Способ изготовления коллагеновых покрытий для использования в офтальмологии Советский патент 1992 года по МПК A61K38/17 A61F9/00 

Изобретение относится к офтальмологии, а именно к коллагенопластике, и может быть использовано для повышения качества хирургического лечения врожденной и приобретенной патологии зрения.

Цель изобретения повышение выхода и чистоты целевого продукта.

Способ осуществляют следующим образом.

Склеру Глаз сельскохозяйственных животных тщательно очищают от внутренних оболочек, остатков конъюнктивы, мышц и проч. и выделяют строму, которую нарезают небольшими кусочками. Навеску ткани промывают дистиллированной водой до полного удадения механических примесей и крови, переносят в колбу и заливают 10%ным раствором едкого натра в насыщенном растворе сернокислого натрия (из расчета 500 мл раствор на 10 г ткани) на 48 ч при 18°С. Раствор сливают и проводят нейтрализацию ткани до рН 6,0-7,0, перемешивая ее в 2%-ном растворе борной кислоты и

неоднократно меняя раствор. Ткань промывают дистиллированной водой до полного удаления иона сульфата в промывной жидкости и заливают 1 М раствором уксусной кислоты из такого расчета, чтобы конечная концентрация белка в растворе составляла 1%. Массу перемешивают и оставляют в )$олодильнике на 1-3 сут при 4°С, Массу гомогенизируют, центрифугируют 30 мин при

00 2000. об/мин и оставляют на 1 сут при 4°С.

ю Полученный раствор фильтруют через стекXIлянный фильтр. Для изменения конформации макрочастиц в полидисперсной системе и снижения величин вязкости раствора колдагенд проводят изоэлектрическое осаждение коллагена в пределах рН 4,2-8,6, что значительно облегчает дальнейшую очистку койлагена от низкомолекулярных примесей. Для этого к раствору коллагена в 0,25 М уксусной кислоте добавляют эквивалентное количество едкого натра в форме 1-10%-ного раствора едкого натра, С помощью диспергатора при скорости вращения ротора

10000-20000 об/мин, в течение 6-3 мин получают гомогенную дисперсную систему с размером частиц коллагена в дисперсной фазе 5-25 мкм.

Данная операция необходима, так как улучшает условия очистки и повышает степень очистки за счет того, что все частицЫ дисперсной фазы имеют одинаковую поверхность и равномерно распределяются в объеме дисперсной среды,

Полученную дисперсию коллагена разбавляют солевыми растворами или буферныгО|и смесями с низкой ионной иглой (0,002 М) до концентрации/О,1-0,2 вес.%, снижая, таким образом, возможность ассоциации макрочастиц и повышая эффективность очистки. Разбавленную дисперсию подают под давлением для циркуляции в замкнутую си.стему, включающую трубки диаметром 2-3 мм, стенки которых представляют собой полупроницаемую мембрану. Все молекулы, мол. масса которых меньше 10000 дальтон, проходят через стенки и удаляются с потоком фильтрата.

Непрерывная циркуляция дисперсии в системе обеспечивает постоянное перемешивание Дисперсии вдоль рабочей поверхности ультрафильтрационной мембрану. Очистка и концентрирование дисперсии коллагена идут за счет ультрафильтрации, через полупроницаемую мембрану (стенка трубы). ЦиркуляцикЗ и перепад давления по разные стороны мембраны обеспечивает перистальтический насос. Давление на внутреннюю (рабочую) поверхность мембраны составляет 0,7 кг/см в начале цикла и 1,8 кг/см в конце цикла. Скорость циркуляции 1,8 л/мин в начале и 0,3 л/мин в конце цикла. Очистку и концентрирование Завершают при концентрации коллагена в дисперсии 0,65-0,75 вес.%.

П р и м е р 1.20 г очищенной и нарезанной ctpoMM склеры заливают 1 л 10%-ного раствора едкого натра в насыщенном растворе сернокислого натра и оставляют на 4В ч при 15-18°С. Раствор сливают и проводят нейтрализацию ткани до рН 6,0-7,0, непрерывно перемешивая на магнитной мешалке в 2%-ном растворе борной кислоты (время нейтрализации около 2 ч, общий объем 2%ного раствора борной кислоты около 4 л). Ткань тщательйо промывают дистиллированной водой при осторожном непрерывном перемешивании до полного удаления сульфатиона из промывной жидкости (время промывки около 2 ч, общий объем дистиллированной, воды около 5 л), К полученному объему обводненной ткани добавляют равный объем 0,5 М уксусной кислоть|, перемешивают и оставляют на 1 сут

при 4°С. Массу гомогенизируют, центрифугируют 30 мин при 2000 об/мин, и оставляют на 3 сут при 4°С. Готовят 1 %-ный раствор коллагена в 0,25 М уксусной кислоте. Полученный раствор фильтруют через стеклянный фильтр.

К200 мл полученного раствора добавляют 1 г едкого натра в форме 1-10%-ного раствора едкого натра, интенсивно перемешивая раствор коллагена после добавления каждой порции раствора Щелочи. С помощью диспергатора при скорости вращения ротора 20000 об/мин в течение 3 мин получают гомогенную дисперсную систему

рН 4,2 с размером частиц коллагена в дисперсной фазе 5 мкм. Полученную дисперсию разбавляют 0,002 М буферной смесью рН 5.4-5,6 до О , 1-0,2 вес. % кол л areна, еще раз диспергируют 3 мин при 20000

об/мин и подают для циркуляции в систему, выключающую сосуд, перистальтический, насос, систему трубок диаметром 2-3 мм,, стенки которых являются полупроницаемой мембрансэй. Перистальтический насос обеспечивает начальную скорость циркуляции дисперсии коллагена в системе 1,8 л/мин при начальном давлении на внутреннюю (рабочую) поверхность полупроницаемых трубок в 0,7 кг/см. По мере концентрирования дисперсии скорость ее циркуляции сни жается до 0,3 л/мин, а давление на рабочую поверхность полупроницаемых трубок возрастает до 1.8 кг/см .

Ультрафильтрацию заканчивают при

концентрации коллагена в дисперсии 0,75 вес.%.

Далее процесс идет в соответствии с прототипом: полученную дисперсию центрифугируют 15 мин при 1000 об/мин,

разливают на матрицы, повторяющие,сферический контур переднего отрезка глаза, проводят воздушную сушку в пылезащитном шкафу 48 ч при 15°С и относительной влажности воздуха 40-50%. Готовые издеЛИЯ подвергают радиационнрй стерилизации в у-лучах при дозе 25 кГрей и мощности 5 кГрей/ч. Стерильность материала подтверждают контрольным бактериологическим исследованием готовых изделий,

Кислотно-щелочное срстояние готовых изделий определяют контрольной рН-метрией водной вытяжки навески готовых изделий. Значение рН изделий из данного варианта 5,4. Количество иизкомолекулярных примеДМ

сей определяют по формуле тос- ОО- где

Д М - изменение массы готовых изделий относительно их первоначальной массы Mi после промывки их в сверхчистой воде. Содержание низкомолекулярных примесей в готовом изделии для данного варианта составляет 0,9%.

Приме р 2. Аналогичен примеру 1, за исключением того, что к 200 мл 1%-ного раствора коллагена в 0,25 М уксусной кислоте добавляют 1,5 г едкого натра в форме 1-10%-ного раствора едкого натра. С помощью диспергатора при скорости вращения ротора 10000 об/мин в течение 6 мин получают гомогенную дисперсную систему рН 5 с размером частиц коллагена в дисперсной фазе 25 мкм. Полученную дисперсию разбавляют 0,002 М раствором ацетата натрия рН 7,2 до концентрации коллагена 0,10,2 вес.%, еще раз диспергируют при тех же условиях (б мин, 10000 об/мин) подвергают ультрафильтрации до концентрации коллагена в дисперсии не менее 0,65 вес.%, далее аналогично примеру 1.

Контрольная рН-метрия водной вытяжки навески готовых изделий показывает значение рН 6,8. Содержание низкомолекулярных примесей в готовых изделиях составляют 1-1,5%.

При М е р 3; Аналогичен примеру 1, за исключением того, что к 200 мл 1 %-ного раствора коллагена в 0,25 М уксусной кислоте добавляют 2,5 г едкого натрия в форме 1-10%-ного раствора едкого натра. С помощью диспергатора при скорости вращения ротора 20000 об/мин в течение 3 мин получают гомогенную дисперсную систему рН 8,6 с размером частиц в дисперсной фазе 5-10 мкм. Полученную дисперсию разбавляют дистиллированной водой до концентрации коллагена 0,1-0,2 вес.%, ещё раз диспергируют при тех же условиях (3 мин, 20000 об/мИн), Ультрафильтрацию проводят аналогично примеру 1 до концентрации коялагена-е дисперсии 0,65-0,75 вес.%. Далее к очищенной дисперсии коллагена до бавляют дексазон из расчета 0,5 мг на каждое изделие При формовании и сушке применяют вибрационное воздействие. Радиационную стерилизацию готовых изделий проводят при-19ё°С при дозе у-излучения 25 кГрей и мощности 5 кГр/ч. Сохранность / ексазона после стерилизации определяется на приборе изотахофор фирмы LKB и составляет 98% от исходного количества. Контрольная рН-метрия водной вытяжки навески готовых изделий показывает значение рН 7,6.

Использование предлагаемого способа

изготовления коллагеновых покрытий для офтальмологии позволяет существенно повысить как выход целевого продукта, так и степень очистки коллагена от низкомолекулярных примесей за счет последовательного использования в предлагаемом способе изоэлектрического осаждения коллагена, диспергирования, 8-10 кратного разбавления дисперсии коллагена, циркуляции и концентрирования дисперсии посредством

ультрафильтрации. Скорость очистки возрастает в 5-6 раз, а эффективность очистки в 5 раз по сравнению с прототипом.

Формула изобретения

Способ изготовления коллагеновых покрытий для использования в офтальмологии, заключающийся в том, что из склеры глаз животных выделяют строму, промывают, обрабатывают щелочно-солевым раствором, нейтрализуют, промывают, обрабатывают уксусной кислотой, гомогенизируют, центрифугируют, полученный раствор коллагена фильтруют через стеклянный фильтр, удаляют низкомолекулярные примеси, повторно центрифугируют, раствор коллагена помещают в форму, высушивают, формуют и Стерилизуют, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода и чистоты целевого продукта, после

получания фильтрации раствора коллагена и фильтрации через стеклянный фильтр производят изоэлектрическое осаждение коллагена и диспергируют полученную смесь, а удаление низкомолекулярных примесей из дисперсии

производят путем ультрафильтрации.

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для изготовления крллагеновых покрытий, используемых в офтальмологии. Цель изобретения - повыше-, нйе выхода и чистоты целевого продукта. Для этого 4/13 склеры глаз выделяют строму. Из нее получают раствор коллагена, который фильтруют через стеклянный фильтр. Затем проводят изозлектрическое осаждение коллагена. Полученную смесь диспергируют, а целевой продукт отделяют от низкомолекулярных примесей ультрафильтрацией дисперсии. ,,