Способ определения углеводородокисляющей активности микроорганизмов Советский патент 1992 года по МПК C12N1/20 C12Q1/16 

Изобретение относится к защите материалов от биоповреждений и может быть использовано при определении концентрации углеводородокисляющих бактерий и микромицетов и их водорастворимых метаболитов для оценки активности углеводородокисляющих микроскопических грибов и бактерий.

Особенностью усвоения мицелиальны- ми грибами и бактериями жидких углеводородов нефти является обязательное наличие двухфазной среды: жидкий углево дород - водно-минеральный раствор, в которой при развитии микромицетов и бактерий происходит образование биомассы на границе фаз, а в водной фазе - накопление продуктов метаболизма.

Известен способ определения концентрации микроорганизмов, заключающийся в том, что пробу микроорганизмов инокулиру- ют в лактозный бульон, содержащий С1 -замещенную лактозу, и подвергают инкубированию в течение определенного времени при 37°С. Концентрацию микроорганизмов оценивают по количеству выделяющегося радиоактивного С1402.

Недостатками способа являются неизбежное искажение результатов исследования, сопряженное с потерей С1402 в процессе его улавливания, с влиянием банальной микрофлоры, а также невозможность определения их активности.

Наиболее близким к предлагаемому способу по технической сущности является способ определения концентрации микроорганизмов, заключающийся в измерении радиоактивности нативных и термоанактиви- рованных микроорганизмов, причем инкубирование нативной пробы с радиоактивным изотопом проводят при 2-8°С в течение 18- 24 ч, а инактивиррванной - при той же температуре не менее 2 ч. В качестве

Х| VJ

О N3 )

радиоактивного изотопа используют Р в виде двухзамещенного фосфорно-кислого натрия. С помощью калибровочной кривой по уровню активности Р , который включается в клетки при ассимиляции, находят концентрацию живых микроорганизмов. По концентрации микроорганизмов можно судить об активности их развития.

Недостатком известного способа является ограниченная возможность его практического применения, а также недостаточная точность определения активности.

Например, в ряде случаев возникает необходимость определения наряду с концентрацией микроорганизмов их водорастворимые метаболиты. Так, при протекании микробиологических процессов в топливных емкостях в системах техники в засорении топливных агрегатов существенную роль играет биомасса, а в процессе повреждения материалов топливных систем-водорастворимые продукты метаболизма (органические кислоты, аминокислоты и т.п.). Поэтому для достоверной оценки микробиологического засорения топливных емкостей и систем техники в случае выделения из ни бактерий и микромицетов требуется определить углеводородокисляющую активность выделенных микроорганизмов. Уг- леводородокисляющэя активность оценивается по количеству биомассы либо водорастворимых метаболитов, образующихся при развитии бактерий и микромицетов в углеводород - водно- мииеральной среде. Однако известный способ не позволяет учитывать кроме концентрации микроорганизмов (биомассы, ассимилирующей изотоп Р32) другие продукты жизнедеятельности микроорганизмов.

Целью изобретения является повышение точности определения.

Способ заключается в культивировании суспензии бактерий или спор исследуемого микромицета в двухфазной .среде: жидкий углеводород-водно-минеральная среда, в углеводородную фазу которой предварительно введен радиоактивный изотоп -тритий (Н3) при или 30-37°С в течение 10-15 или 1-3 сут для бактерий и микромицетов соответственно, после чего проводят отделение биомассы (клеток микромицета или бактерий) и водной фазы. Возможность осуществления способа обусловлена применением радиоактивного изотопа трития, введенного в концевую группу н-октадека- на, который живые клетки гриба поглощает и окисляет его в стеариновую кислоту. Единственный протон в карбоксильной группе (Н3) является подвижным и обменивается с

внешней средой (водно-минеральным раствором):

СН3(СН2)(СН2)1б

СООН - СНз(СН2)1бСОСГ

Таким образом, использование в качестве радиоактивного изотопа трития, введенного в углеводородную фазу, позволяет по его накоплению в биомассе и в водной фазе учитывать и определять наряду с концентрацией углеводородокйсляющих микромицетов или бактерий и их водорастворимые метаболиты. Указанное обстоятельство расширяет возможности способа подготовки проб живых микроорганизмов и повышает объективность определения активности углеводородокйсляющих микроорганизмов.

Определение активности углеводородо- кисляющих микроорганизмов заключается в измерении радиоактивности биомассы (клеток) микроорганизмов и водной фазы,

содержащей водорастворимые метаболиты, образовавшихся при культивировании исследуемых штаммов бактерий или микромицетов в двухфазной среде жидкий углеводород- водно-минеральный раствор.

в углеводородную фазу которой предварительно введен н-октадекан, меченный по концевой группе Н , при благоприятных для развития микроорганизмов температурах (30-37°С для бактерий, 25-30°С - для микромицетов) в течение 1-3 (бактерии) или 10-15 сут (микромицеты) и сравнении полученных значений с величиной радиоактивности биомассы и водной фазы, образовавшихся при культивировании в

аналогичных условиях известных активных штаммов углеводородокйсляющих микроорганизмов. Время инкубирования микромицетов определяется логарифмической фазой роста, в которой наиболее интенсивно протекают процессы образования биомассы и накопления продуктов жизнедеятельности и которая при развитии микромицетов в углеводород-водно-мине- ральной среде составляет 10-15 сут, а для

бактерий - 1-3 сут. Температура 25-30 и 30-37°С выбрана как наиболее благоприятная для развития углеводородокйсляющих микромицетов и бактерий соответственно.

В табл. 1 приведены данные по накоплению радиоактивного изотопа в водной фазе и биомассе штаммов микроорганизмов, выделенных из топлив при их развитии в углеводород-водно-минеральной среде, в

углеводородную фазу которой предварительно введен н-октадекан-Н3. Для получения объективных результатов для исследования выбраны штаммы, образующие при росте в углеводород-водно-мине- ральной среде различную биомассу. В биомассе штаммов с условными номерами t, 8 и 15 обнаружено практически одинаковое количество радиоактивного индикатора. В то же время штамм C.resinae-15 накапливает в водной фазе значительно большее количество радиоактивного индикатора по сравнению со штаммами 1 и 8. В наибольшей степени способность образовывать водорастворимые продукты жизнедеятельности выявлена у штамма C.resinae-16. Наименьшее количество радиоактивного индикатора установлено как в биомассе, так и в водной фазе штамма 1701. В биомассе штаммов Acremonium kiliense и Chrysosporium sp. обнаружено приблизительно одинаковое количество радиоактивного изотопа, в то время как в водной фазе A.ktlieuse содержание изотопа в 5 раз выше, чем в водной фазе Chrysosporium sp. При культивировании штаммов PenicllMum jenseni и Pseudomonas sp. основное количество радиоактивного изотопа накапливается в водной фазе, а при культивировании Mycobacterium sp. - в биомассе.

Таким образом показано, что перераспределение радиоактивного индикатора происходит в зависимости от углеводородо- кисляющей способности штамма с учетом, его способности образовывать как биомассу, так и водорастворимые продукты жизнедеятельности, в том числе органические кислоты. Это позволяет проводить измерение радиоактивности непосредственно в биомассе (клетках), а также в водной и углеводородной фазах после инкубирования микромицетов с меченым соединением.

Как видно из табл. 1, из пяти штаммов C.resinae штамм 16 является наиболее активным, так как для него установлено наибольшее накопление радиоактивного изотопа в биомассе и водной фэзе. Для сравнения в табл. 1 приведены данные по количеству сухой биомассы, образуемой исследуемыми штаммами, исходя из которых, наиболее активным считают штамм C.resinae-1. Использование способа позво ляет учесть наряду с образующейся биомассой накопление водорастворимых продуктов метаболизма, что повышает объективность определения активности углево- дородокисляющих микромицетов.

Л р и м е р 1. В каждую из 12 пробирок (по 3 пробирки на каждый вариант) наливают по 3 мл водного минерального раствора.

имеющего следующий состав, %: азотнокислый калий 0,2: сернокислый магний 0.04; фосфорнокислый однозамещенный калий 0,03; фосфорнокислый двузамещенный на5 трий 0,07; рН раствора 7. Затем йносят по 0,3 мл суспензии спор гриба исследуемого штамма и штамма сравнения с концентрацией 10 спор/мл и добавляют по 0,5 мл н-додекана с введенным в него н-октадека10 ном, меченым по концевой группе тритием (удельная активность 2,45 мКи/мл).

Контрольные варианты необходимы для учета явлений гашения сцинтилляции, воз5 пикающих в связи с окраской биомассы и минерального раствора, а также обработанной биомассы солюбилизатором.

Инкубирование приготовленных смесей проводят при 25-30°С в течение

0 10-15 сут без принудительного встряхивания.

Для получения средней (из трех повтор- ностей) пробы биомассы объединяют и одновременно обрабатывают биомассы,

5 выросшие в трех разных пробирках одного варианта. Выросшие на границе раздела фаз топливо-инеральный раствор биомассы микромицетов (в виде пленки) микологическим крючком переносят-в чистую сухую

0 пробирку и промывают на холоду охлажденным до 4°С додеканом последовательно 4-5 раз, причем каждый раз новой порцией (1 мл)додекана. Охлаждение необходимо для предотвращения процессов

5 окисления н-октадекана и потери радиоактивной метки при промывании биомассы.

Биомассу, отмытую от сорбированного на ее поверхности углеводорода, гомогенизируют в механическом диспергаторе в 2 мл

0 солюбйлизатора(солюбилизатор Т-1 фирмы Cinsser Analytic, GMBH).

В сцинтилляционные флаконы, содержащие по 5 мл сцинтилляционной жидкости (ЖС-109; раствор 5 г 2,5-дифенилоксазола и

5 0,2 г п-бис- 2-(5-фенилоксазоил)-бензола в 1 л сцинтилляционного толуола) вводят пробы минерального раствора (100 мкл) из каждой пробирки в отдельный флакон и средние пробы биомассы в растворе солюбилизато0 ра (500 мкл).

Измерения радиоактивности препаратов проводят на жидкостном сцинтилляци- онном счетчике радиоактивных излучений, например Mark-ll (Голландия).

5 По полученным результатам производят перерасчет радиоактивности препаратов каждой фракции (биомассы, минерального раствора) с учетом отобранного для анализа объема пробы и общего количества фракции.

Оценка активности исследуемого мик- ромицета, произведенная в сравнении с активностью известного штамма, показала большую активность исследуемого штамма (табл.2).

Пример 2. В приготовленную по примеру 1 среду (углеводород-водно-мине- ральный раствор) вносят по 0,3 мл суспензии клеток бактерий исследуемого штамма и штамма сравнения с концентрацией 106 клеток/мл (по стандарту мутности). Инкубирование приготовленных смесей проводят при 30-37°С в течение 1-3 сут при перемешивании (120 об/мин).

После инкубации с изотопом клетки ис- следуемого и сравниваемого штаммов бактерий отделяют от водной фазы, а затем трехкратно отмывают охлажденным до 4°С додеканом с последующим сливом суперна- танта и ресуспензированием осадка (клеток) в 2 мл солюбилизатора.

В сцинтилляционные флаконы, содержащие по 5 мл сцинтилляционной жидкости, вводят пробы водной фазы (200 мкл) из каждой пробирки в отдельный флакон и средние пробы клеток бактерий в растворе солюоилизатора (500 мкл).

Измерение и расчет радиоактивности препаратов проводят по примеру 1.

Оценка активности исследуемого штам- ма бактерий, произведенная в сравнении с активностью известного штамма по сумме

радиоактивности клеток и водной фазы, показала большую активность штамма сравнения (табл. 3).

Способ позволяет достоверно определить активность углеводородокисляющих микроорганизмов, что имеет большое практическое значение при выборе штаммов для оценки биостойкости топлив, в том числе вновь разрабатываемых. Объективная оценка микробиологической устойчивости нефтяных дистиллятных топлил позволит избежать отказы и неисправности топливной системы техники, вызванные биологическим повреждениям топлив.

Формула изобретения Способ определения углеводородокис- ляющей активности микроорганизмов, предусматривающий культивирование микроорганизмов на питательной среде в оптимальных условиях с радиоактивным изотопом с последующим его определением в биомассе, отличающийся тем, что, с целью повышения точности определения, культивирование проводят в двухфазной среде, состоящей из жидкого углеводорода и водно-минерального раствора, содержащей в качестве жидкого углеводорода н-ок- тадекан, меченный по концевой группе тритием, и дополнительно проводят определение радиоактивного изотопа в водной среде.

Изобретение относится к защите материалов от биоповреждений и может быть использовано при определении концентрации микроорганизмов и их водорастворимых метаболитов для оценки активности углеводородокисляющих микроскопических грибов и бактерий. Целью изобретения является повышение точности определения активности углеводородокисляющих микроорганизмов. Способ заключается в инкубировании суспензии бактерий или спор исследуемого микромицета в двухфазной среде, например жидкий углеводород - водно-минеральная среда, в углеводородную фазу которой предварительно вводят радиоактивный изотоп - тритий, при 25-30 или 30-37°С в течение 10-15 или 1-3 сут для микромицетов или бактерий соответственно, после чего проводят отделение биомассы и водной фазы. 3 табл.

Примечание: Количество и-октадекана-Н в исходном топливе 1,4038 мкМ.

Доверительный интервал с 95 %-ной вероятностью составляет ±11%.

35

Таблица 1

fl рим е ч а н и е. Доверительный интервал с вероятностью 95% составляет ± 11 %

Пр и м е ч а н и е. Доверительный интервал с вероятностью 95% составляет ±11 %

Таблица 2

Та блица 3