Способ подготовки пробы живых микроорганизмов к определению их концентраций Советский патент 1979 года по МПК C12K1/00 

Настоящее изобретение относится X микробиологии и может быть использовано при определении концентрации микроорганизмов в ветеринарии и медицине. Наиболее близким к изобретению по технической сущности является способ подготовки пробы живых микроорганизмов к определению их концентрации, заключающийся в том, что пробу микроорганизмов инокулируют и лактозный бульон, содержащий с. -замещеннуюлактозу, и подвергайт инкубированию в течение оп ределенногб времени при 1. бактерии в процессе роста расщепляют радиоактивную лактозу; вьщёляющийся радиоактивный С Oj адсор бируется гидроокисью бария с образованием при этом радиоактивного . Уровень радиоактивности вь ленной культурой микроорганизмов п отношению ко времени является вели ной прямо пропорциональной числу микрюбных клеток в пробе. Для того чтобы определить количество живых бактерий по такому сп собу требуются специальные приспособления, обеспечивакндие наиболее полное улавливание высвобождающего ся в процессе расщепления лактозы С О2, что сопряжено с потерей с О и неизбежным искажением результатов исследований. Культивирование микроорганизмов по этому способу производят при 37°С, что чревато опасностью роста бйнальйой -микрофлоры (стрептококки, стафилококки, грибки и др.). При анализе молока и молочных продуктов в пробе могут оказаться и патогенные микроорганизмы (бруцеллы, возбудители паратифа и др.), которые также активно расщепляют лактозу. В связи с этим конечный результат измерения радиоактивности С Oj не может быть отнесен к определенному виду бактерийi Следовательно, получаемый результат не позволяет судить о точном количестве клеток в исследуемом образце. С целью упрощения процесса подротовки и повышения точности определения концентрации нативных микроорганизмов инкубирование проводят с радиоактивным изотопом , взятым в виде двузамещенного фосфата натрия, при 2-8С, в течение 18-24 ч, после чего клетки микроорганизмов отделяют от- супернаТаНТа..

В основе изобретения лежит способность живых клеток активно-ассимилировать вещества, необходимые для их жизнедеятельности, в отли-чие от мертвых, накапливающих химические соединения только по законам сорбции и диффузии. Это позволяет проводить измерение радиактивности непосредственно в клетках при включении радиоактивного изотопа после инкубации их с меченым соединением. Указанное обстоятельство упрощает процесс и повышает точность опредеделения. Определение концентрации микроорганизмов заключается в изМёрении радиактивности нативных и термойнактивированных микроорганизмов, причем инкубирование нативной пробы с радиоактивным изотопом проводят при 2-8°с в течение 18-24 ч а инйктивйрованнбй - при той же температурё не менее 2 ч. В качестве радиоактивного изотопа используют Р в виде двузамещенного -фосфорнокислого натрия. С помощью калибровочной кривой по уровню активности Р, ко±орый включается в клетки при ассимилйции, находят концентрацию живых микроорганизмов.

Характерно отметить,что концентрацию живых бактерий в исследуемом препарате можно определить в течение суток, что в несколько раз быстрее бактериологического метода высева культуры в чашки с. агаром. На фиг. 1 показана зависимость интенсивнооти ассимиляции и сорбции изотопа соотвест-венно нативными и термоинактивированными.клетками BruceEto abortus (шт. 19) от удельной актлвности р при инкубации в интервале 0,25-4 мккюри/мл (концентрация бруцелл составляет 200 млрд Микробных тел/мл) ; на фиг. 2 - зависимость количества радиоактивного изотопа, связавшегося при ассимиля ции живыми и при сорбции мертвыми клетками, от концент-рации бруцелл.

Как видно из фиг. 1 интенсивность ассимиляции, изотопа Р живыми бруцеллами (1) в несколько раз превышает сорбцию его мертвыми клетками (2). Скорость счета Р от нативных бруцелл пропорционально возрастает при увеличении концентрации ( И ). Активность сорбированного изотопа также возрастает с увеличением,, концентрации термойнактивированных клеток ( Nj ) , но. на порядок меньше (см. фиг. 2).

Обнаруженные закойомерности-ПОЗВОЛЯЮТ построить калибровочную кривую зависимости AN N, - Nj от концентрации живых Микроорганизмов, где W, и Яг соотвествённо активность i р в нативной и тёрмоййактйвированной пробе.

Пример. Бакмассу с неизвестной концентрацией клеток стерильно разливают по 5 мл в две центрифужные пробирки. Одну из проб инактивируют нагреванием при Т + ЮО в течение 30 мин. К охлажденной пробе термойнактивированных клеток и к пробе с нативными клетками добавляют радиоактивный паствор двухзамещанного Фосфорнокислого натрия, так чтобы удельная активность Р в пробах составляла 4 мккюри/мл. Интактные и термоинактивированные клетки с радиоактивным изотопом оставляют на экспозицию при . В этих температурных условиях не наблюдается роста и деления клеток.

Инкубирование нативных кЛеток с радиоизотопом проводят в тече32 / ние 18-24 ч, так как количество Р обнаруживаемое при ассимиляции живыми клетками, к этому времени достигает максимальных значений. Сорбция изотопа инактивированными клеткми достигает максимума уже после двух часовой экспозиции.

После инкубации с изотопом клетки обеих проб четырехкратно отмывают центрифугированием в течение 20 мин на ЦУМ-1 при 4000 об/мин с последующим сливом супернатанта и ресуспензированием осадка в 10 мл воды.

Отмытые клетки разводят до исходной концентрации, добавляя 5 мл воды, суспендируют и используют для анализа. Из каждой.пробы берут по 1 ил суспензии клеток трехкратно

Образцы помещают на мишени-подлоки, высушивают и изменяют активност изотопа Р на радиометрической установке типа Б-2 с торцо.вым счетчик типа Т-25-БФЛ (или на жидкостном сцинтилляционном спектрометре типа ABAC SL-40 без высушивания образцов) в нативной N, и термоинактивированной 2 пробах. По значению с помощью калибровочной кривой дН (см. фиг.:- 2) определяют концентрацию живых микроорганизмов.

Формула изобретения

Способ подготовки пробы живых микроорганизмов к определению их концентрации в пробе, включающий инкубирование микроорганизмов с радиоактивным изотопом, отличающийся тем, что, с целью упрощения процесса подготовки и повышения точности определения концентрации нативных микроорганизмов, инкубирование проводят с радиоактивHtm изотопом Р , взятым в виде . двуэамещенного фасфата натрия, при 2-8 С в течение 18-24 ч, после чего клетки микроорганизмов.отделяют от суспернатанта.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

I. Патент США 2.914.447, кл. 195-103,5, 1959.

10

I

l«

I

5, г

a |г5

0 0,5 23If

Удельная активность P , liKKtopi /fi/i

РигЛ

0W во Ш 160

Концентраи й пипроарганизно&, г лрд/пл