Способ выделения вирусных антигенов Советский патент 1992 года по МПК C12N7/00 

Изобретение относится в области медицины и ветеринарии, а именно к химическим методам получения белковых фракций виру- сов, и может быть использовано при конструировании диагностических препаратов.

Известен способ получения вирусных антигенов путем осаждения вариантов по- лиэтиленгликолем (ММ 6000) или высаливания сульфатом аммония.

Однако эти методы характеризуются низким выходом и недостаточной степенью очистки вирионов, что не позволяет получать воспроизводимые результаты.-.: Известен также фильтрационно-хрома- тографический метод, объединяющий в себе преимущества микрофильтрации и молеку- лярно-ситовой хроматографии.

Известен способ выделения вирусных антигенов, включающий следующие операции: после появления полного цитопатиче- ского действия вируса культуральную жидкость вместе с клетками собирают и центрифугируют 10 мин при 3000 об/мин. В дальнейшем из осадка клеток антиген экстрагируют в 4 раза 2 %-ным раствором тритона Х-100 в 1 М КСЦрН 7,0). После 30 мин перемешивания при комнатной температуре материал центрифугируют 5 мин при 10000 об/мин. Затем надосадочную жид- кость из 4 проб смешивают. Полученный экстракт является концентратом антигена из клеток.

Недостатками прототипа являются частичная потеря на начальном этапе культу- ральной, вирусосодержащей среды,

ю

4 СО N)

представляющей собой запас вирусного белка; неполная экстракция клеток, содержащих вирусные белки; структурные нарушения вирусных антигенов; низкая активность выделенных белков.

Цель изобретения - повышение выхода целевого продукта.

Поставленная цель достигается тем, что в способе выделения вирусных антигенов путем осаждения клеточно-культуральной среды, экстрагирования антигенов раствором, содержащим хлорид калия, и последующего центрифугирования, осаждение клеточно-культуральной среды проводят смесью следующего состава. об%;

Твин20 7-13

10%-ный раствор хлорида кальция 10- 20

32-40%-ный раствор ПЭГ (м.в, 4000- 6000) на

растворе Хенкса рН 7,2-7,4 Остальное

при постоянном перемешивании в течение 4-5 ч при 4... 10°С, затем смесь центрифугируют при 4300-5200 g в течение 35-40 мин, а экстрагирование антигенов из образовавшегося осадка проводят 0,02%-ным раствором Версена, содержащим додецилсульфат натрия и хлорид калия при следующем соотношении компонентов, г/л: додецилсуль- фат натрия 8-12; хлорид калия 74-75, в течение 1,5-2 ч с последующим центрифуги- рованием экстракционной смеси при 8600- 10400 g в течение 10-15 мин с отделением супернатанта.

Обоснование количества ингредиентов состава для преципитации (ПС) и экстрагирования антигенов (ЭС), используемых при осуществлении предлагаемого способа.

Отклонения; допущенные при приго- товлении состава ПС и ЭС в сторону увеличения или уменьшения количеств влияют на качество получаемой субстанции вирусных белков.

Качественно-количественный состав ПС и-ЭС обоснован оптимальными резуль- татами выделения максимального количества обогащенной фракции вирусных.белков (табл.1).

Обоснование указанных режимов пред- ставленнов табл. 2.

Такие ингредиенты, как Твин-20 (40 или 80), 10%-ный раствор хлорида кальция и додецилсульфат натрия, а также и композиционный ЭС и ПС предложены для выделе- ния вирусных белков впервые.

. Длительность хранения ПС и ЭС составляет 12±2 мес при 5+2°С.

ПС получают следующим образом. Предварительно готовят 32-40%-ный раствор полиэтиленгликоля (ПЭГ) м.в. 4000- 6000 на растворе Хенкса. Затем берут 7-13 мл Твина 20, 40 или 80, добавляют 10-20 мл 10%-ного хлорида кальция (коммерческий раствор в ампулах) и доводят смесь до 100 мл ранее приготовленным 32-40%-ным раствором ПЭГ.

Таким образом получают ПС следующих составов, мл;

i Твин-207

10%-ный раствор хлорида кальция 10 32%-ный раствор ПЭГ (м.в.4000) на растворе Хенкса рН 7,2до 100

20

ЛТвин-40 13

10%-ный раствор хлорида кальция

40%-ный раствор ПЭГ (м.в.6000) на растворе Хенкса рН 7,4 до 100

ШТвин-8010

10%-ный раствор хлорида кальция 15

36%-ный раствор ПЭГ(м.в.5000) на растворе Хенкса рН 7,3 до 100

ЭС получают следующим образом. 0,8- 1,2 г додецилсульфата натрия и 7,4-7,5 г хлорида калия растворяют в 10 мл 0,02%-но- го раствора Версена (коммерческий).

Таким образом были получены следующие составы ЭС:

IVДодецилсульфат натрия 0,8 г Хлорид калия 7,4 г

0;02%-ный раствор Версена (коммерческий) до 100 мл

VДодецилсульфат натрия 1,2 г Хлорид калия 7,5 г

0,02%-ный раствор Версена (коммерческий) до 100 мл

VIДодецилсульфат натрия 1,0 г Хлорид калия 7,45 г

0,02%-ный раствор Версена (коммерческий) до 100 мл

П р и м е р 1. Выделение вирусного антигена из ККС, содержащей РСВ. Респи- раторно-синцитиальный вирус (РСВ) штамм Long культивируют по разработанному способу, однако возможно культивирование РСВ любым другим известным способом.

ККС разделяют на 2 равные части, одну из которых - контрольную, обрабатывают известным способом. Опытную часть обрабатывают следующим образом.

В ККС. взятую в объеме 1 л с исходным титром 1:2095, вносят преципитационную смесь состава, мл. .

Твин-20 7

10%-ный раствор хлорида кальция 10

32%-ный раствор ПЭГ м.в. 4000 на растворе

Хенкса рН, 7,2 в количестве 200 мл до 100мл

Полученную смесь инкубируют при постоянном перемешивании на магнитной ме- шалке в течение 5 ч при 4°С, затем центрифугируют при 4300 g, в течение 40 мин. Супернатант сливают, а к осадку добавляют экстракционную смесь (ЭС) состава:

Додецилсульфат натрия 0,8 г

Хлорид калия 7,4 г

0,02 % раствор Версена (коммерческий) До 100мл

из расчета 7 мл ЭС на осадок, полученный из 1 л преципитированной ККС. Полученную взвесь инкубируют при перемешивании на магнитной мешалке при 37°С в течение 1,5 ч и затем центрифугируют при 8600 g в течение 15 мин. Супернатант в количестве 12 мл, содержащий белки в количестве 20,68 мг/мл, отделяют и используют в качестве еенситина для приготовления диагностику- мов.

П р и м е р 2. Способ проводят аналогично примеру 1 стой разницей, что в качестве ПС используют состав, мл:

Твин-80 10

10%-ный раствор хлорида кальция 15

36%-ный раствор ПЭГ м.в. 5000 на paq- творе

Хенкса рН 7,3 До 100

Полученную смесь, инкубируют в течение 4 ч при 1 0°С, затем центрифугируют при 5200 g в течение 35 мин.

В качестве ЭС используют состав:

Додецилсульфат натрия 1,0 г

Хлорид калия7,45 г

0,02%-ный раствор Версена До 100 мл

инкубацию полученной взвеси проводят при 30°С в течение 2 ч и затем центрифугируют при 10400 g в течение 10 мин. Отделяют супернатант в количестве 9- мл, содержащий418,32 мг/мл белка.

Полученные концентраты вирусных белков (РСВ) анализировали на выявление титров антител в референс-сыворотках; определение структуры нуклеокапсида и наличие вирионов с помощью электронной микроскопии JEM-100B известным способом; содержание белка по методу Лоури.

Выделенные концентраты вирусных белков оценивают в реакции связывания комплемента (РСК) по цитопатическому действию (ЦПД) и в реакции агглютинации целлюлозы (РАЦ). Результаты титрований представлены в табл.3, где на примере се рологических исследований изучена результативность получения Р.С-вирусных белков,

Представленные в табл. результаты по титрованию вирусных белков, полученных по известному и предлагаемому способам, показывают преимущество предложенного 5 способа. При анализе указанных цифровых данных можно отметить, что вирусные белки, полученные по предлагаемому способу, в 3-128 раз превышали по своей активности результаты прототипа.

0 В таблицей представлены усредненные данные по выходу белков, полученные в 19 опытах, а также результаты электронной микроскопии.

Как показывают результаты, приведен5 ные в табл.-4, содержание белков в концентрате, полученном предложенным способом в 4 раза больше, чем известным.

Электрофорез в присутствии додецил- сульфата натрия (ДСН) проводили в полиак0 риламидном геле (ПААГ) на установке Мультифор2117(КВ, Швеция)с применением имидазольного буфера в 10% ПААГ без системы концентрирующего геля. Для лизированных вирусных белков и примесей

5 использовали тот же буфере ДСН безмери- аптоэтанола. Окраску электрофореграмм проводили с помощью красителя кумаси (G -250, Serva, ФРГ).

Общий белок полученных вирусных кон0 центратов представляет, собой вирусные белки, белки клеток для культивирования вируса, включенные в состав вирионов и белков среды культивирования (сывороточные белки).

5 При изучении электрофореграмм вирусных концентратов, полученных по прототипу и предлагаемому способу, отмечено, что в последнем случае происходит полное расщепление не только вирионов, ной инфици0 рованных клеток.

Электрофоретические исследования вирусных концентратов, полученных по прототипу и предлагаемому способу, сопоставлены с данными электрофореза вирионов РС-виру5 са, клеток для культивирования PC-вируса и сыворотки крупного рогатого скота (КРС), Это позволило выявить вирусспецифические и балластные белковые фракции, полученные на электрофореграммах. Материалы прове0 денных исследований представлены в табл.5. Полученные результаты электрофореза позволили заключить, что с помощью предлагаемого способа удается получить значительно большее количество белков, чем по

5 прототипу. Так, на фореграммах выявлено .1.0 различного молекулярного веса белковых фракций, среди которых присутствуют как высоко - .средне-, так и низкомолекулярные белки. В случае электрофореза вирусного концентрата по прототипу возможно получение 4 фракций белка.

Было показано, что специфическими PC-вирусными белками являются фракции белка с ММ 160, 80, 56, 44, 37 и 24 кД. В это перечисление входят как белки суперкапси- да, так и нуклеокапсида (ядро вируса). Пред- ставленные в табл.5 результаты электрофореза показали преимущество предлагаемого способа в сравнении с прототипом. Более того, тканевые белки, содержащие также и вирусные, могут быть с успехом применены для дальнейшей работы по приготовлению диагностических препаратов,

П р и м е р 3. Выделение вирусного антигена из ККС, содержащей вирус диареи

(ВД).

Вирус диареи, штамм Оригон, культивируют известным способом, После получения вирусного урожая ККС разделяют на две равные части. Одну из них - контрольную - обрабатывают по прототипу. К другой части ККС в объеме 1 л и исходным титром 1:4584 добавляют 220 мл ПС состава, мл:

Твин-40 13

10%-ный раствор хлорида кальция 20

40%-ный раствор ПЭГ м.в. 6000 на

растворе Хенкса До 100

Полученную смесь инкубируют при перемешивании на магнитной мешалке в течение 4 ч при 4°С, затем центрифугируют при 4300 g в течение 40 мин. Супернатант сливают, а осадок дезертируют в ЭС состава:

Додецилсульфат натрия 1,2 г

Хлорид калия 7,5 г.

0,02%-ный раствор Версена До 100 мл

ЭС добавляют к осадку в количестве 5 мл на осадок, полученный от 1 л ККС.

Полученную взвесь инкубируют при перемешивании на магнитной мешалке при 37°С в течение 2 ч. Полученный экстракт клеток центрифугируют при 10400 g в течение 15 мин. Получают 9,8 мл супернатанта, 4 содержащего 49,83 мг/мл белка.

В табл.6 представлены данные по определению активности выделенных вирусных белков.

Анализируя представленные в табл, 6 данные по определению активности выделенных вирусных белков в концентрате, можно отметить преимущество предлагаемого метода. При этом титры вирусных белков превышали аналогичные показатели прототипа в 4-8 раз,

В табл.7 представлены результаты электрофореза полученного концентрата.

Из представленных в табл.7 результатов электрофореза видно, что с помощью предлагаемого способа удается выделить 16 фракций белка вместо 6 в прототипе. Из 16 фракций 9 принадлежат суперкапсидной и нуклеокапсидной фракциям ВД, 4 - клеточным белкам и 3 - белкам сыворотки КРС.

По прототипу ЭФ полученного концен- 0 трата позволяет определить только 5 вирус- специфических фракций белка.

В табл.8 представлены усредненные данные по выходу белка и результаты электронной микроскопии, полученные в 23 опы- 5 тах..

Из приведенных данных видно, что выход белка по предлагаемому способу в 5 раз выше, чем в прототипе.

Приме р.4. Выделение вирусных бел- 0 ков из ККС, содержащей вирус инфекционного ринотрахеита (ИРТ).

Урожай вируса ИРТ, штамм № 4016, получают известным образом. ККС инкубируют при 5°С в течение 5 ч при постоянном 5 перемешивании на магнитной мешалке в присутствии ПС состава I.

Преципйтационную смесь вносят в ККС в количестве 200 мл на 1 л ККС. Через 5 ч преципитированную ККС центрифугируют 0 при 5200 g в течение 35 мин, Супернатант сливают, а осадок детергируют в ЭС состава V при соотношении : 6 мл ЭС на осадок, полученный при п риципитации 1 л ККС.

Полученную взвесь инкубируют при пе- 5 ремешивании при 37°С в течение 1 ч 20 мин и затем экстракт клеток центрифугируют при 11000 об/мин в течение 15 мин. Отделяют Супернатант в количестве 9,54 мл и анализируют.

0 В табл.9 представлены результаты титрования полученного экстракта.

Из представленных в табл.9 материалов по титрованию вирусных белков в концентратах видно, что выделение вирусных бел- 5 ков по предлагаемому методу значительно превосходит прототип, Об этом свидетельствуют результаты титрований концентратов в РСК, ЦПД и РАЦ, где данные по предлагаемому методу превосходят прото- 0 тип в 2-8 раз.

Таким образом, независимо от видовой принадлежности, структурных и геномных особенностей предлагаемый метод позволяет получить вирусный концентрат, значи- 5 тельно обогащенной по белку,

В табл.10 представлены результаты электрофореза полученного концентрата.

Представленные в табл.10 результаты электрофореза позволили заключить, что электрофоретическая характеристика вирусного,концентрата, полученного по предлагаемому варианту, содержит значительно большее количество белковых фракций, чем при форезе концентрата, полученного по прототипу: 15 фракций по предлагаемому методу и 6 - по прототипу,

Из 15 фракций белка все, кроме фракций с ММ 190 кД, являются вирусспецифи- ческими, а из 6 - все 6 фракций. Однако в концентрате, полученном по предлагаемо- му методу, на 9 фракций белка больше, чем в прототипе..

Таким образом, получение вирусного концентрата вируса ИРТ по сравнению с прототипом позволяет выделить обогащен- ный спектр белковых фракций суперкапси- да и нуклеокапсидной фракции.

В табл.11 представлены результаты по определению выхода белка и электронной микроскопии. Из данных табл.11 видно, что выход белка по предлагаемому способу в 3 раза выше, чем в прототипе.

Таким образом, преимущество предлагаемого способа состоит прежде всего в том, что для выделения белка на первом этапе используется клеточно-культуральная среда, содержащая вирус и его антигены, обрабатываемая преципитациейной смесью. Это позволяет в значительной степени преципитировать и осадить вирионы, инфицированные вирусом, балластные (сывороточные) белки, свободные вирусные антигены. Затем, на втором этапе, применяя специально подобранный состав (экстракционная смесь), удается в максимальном количестве экстрагировать из инфицированных клеток целый спектр вирусных белков, а также дезинтегрировать вирионы и

таким образом значительно повысить выход белка при одновременном повышении их активности. Располагая широким диапазоном различных белковых фракций, становится возможным получение строго специфических антисывороток для диагностики целого ряда вирусных заболеваний,, что необходимо для своевременной и точной постановки диагноза.

Формула изобретения Способ выделения вирусных антигенов, включающий осаждение культуральной среды, экстрагирование антигенов раствором, содержащим хлорид калия с последующим центрифугированием, о тли чающийся тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта, осаждение культуральной среды проводят смесью следующего состава, :об%:

Твин-207-13; 10%-ный раствор хлорида кальция 10-20; 32-40%-ный раствор поли- этиленпмколя (М.М, мол.М. 4000-6000) на растворе Хенкса рН 7,2-7,4 до 100, при постоянном перемешивании в течение 4-5 ч при 4-10°С, центрифугирование проводят 4300-5200 g в течение 35-40 мин, а экстрагирование антигенов - 0,02%-ным раствором Версена, содержащим додецилсульфат натрия и хлорид калия при следующем соотношении компонентов, г/л: додецилсульфат натрия хлорид калия 74-75; 0,02%-ный раствор Версена остальное,

в течение 1,5-2 ч, после чего экстракционную смесь центрифугируют при 8600-10400 g в течение 10-15 мин, а супернатант отделяют.

Изобретение относится к медицине и ветеринарии, а именно к химическим методам получения белковых фракций вирусов, и может быть использовано при конструировании диагностических препаратов. Цель - повышение выхода целевого продукта. Для осуществления способа в клеточно-культу- ральную среду вносят преципитационную смесь следующего состава, об.%: твин 20 7-13; 10%-ный раствор хлорида кальция 10- 20; 32-40%-ный раствор ПЭГ (м.в. 4000- 6000) на растворе Хенкса рН 7,2-7,4 остальное. Полученную смесь инкубируют при постоянном перемешивании при 4... 10°С в течение 4-5 ч, а затем центрифугируют. К выделенному осадку добавляют экст- ракционную смесь, содержащую додецилсульфат натрия и хлорид калия на 0,02%-ном растворе Версена, и инкубируют в течение 1,5-2 ч. Затем экстракционную смесь центрифугируют и отделяют суперна- тант. 11 табл.

Ингредиенты

Увеличение от указанного

Количество

Нарушение структуры вирусных белков

Таблица

указанного

Количество ингредиентов

Уменьшение от указанного

Недостаточная преципитация вирусных белков

Неполное экстрагирование преципитата

нкубация

ентрифугирование

кстрагирование: нкубация

ентрифугирование

ппгч.уиачпл , содержащей вирус более 5 при +10°С отрицательно сказывается на структуре выделяемого белка

Центрифугирование преципи- тированной ККС, содержащей вирус, более 6000 об/мин в течение 35 мин отрицатель-, но влияет на структурные свойства выделяемой фракции белка

Инкубация преципитата при t выше 37°С в экстракционной смеси более 2 ч приводит к нарушению структурных образований выделяемой фракции белка .,

Центрифугирование экстракта более чем при 12000 об/мин в течение 15. мин способствует уменьшению выделяемой белковой фракции

5000 об/мин 4300g 6000 об/мин 5200g

ГККС - клеточно-культуральная среда

1:24576,6+8,35

А- прототип

В- предлагаемый способ

Таблица2

вирус менее 4 ч при не позволяет добиться максимальной преципитации белков

Центрифугирование преципи- тированной ККС менее 5000 об/м в течение 40 мин не позволяет получать ПЛОТ.НЫЙ осадок преципитата, содержащего белки

Инкубация преципитата при t ниже 30°С в экстракционной смеси менее 1,5 ч приводит к значительному уменьшению выделяемой фракции белка

Центрифугирование экстракта менее, чем при ЮОООоб/мйй в течение ТО мин приводит К потере белка

10000 об/мин 8600g 12000 об/мин 10400g

ТаблицаЗ

Предлага- емый

1:2095 5,713,51±0, 10+2,01:18920,,99 1Э,4.2$2,Структурануклеокапсида 553,2

-сохранена и содержится в

. большом количестве в поле

. .зрение. Отйенемо содержание вирионов РСВ

Поототип lOOOilO , -1:2095 5,713,51±0,04 1041,71:655447,165,,15Нуклеокапсид скомкован и 11(7,0

.содержится в незначитель.ном количестве 4j

Примечание. ККС - клеточно-культуральная среда, содержащая респираторно-еинцитиальный, вирус (РСВ). Обоими белок - по Лорри.

со

.Ь 00 N0

Т а б л и ц а 5

Таблицаб

Т а б л и ц а 7

Предлагав- 1000J12 мый

1:4569,7±17,35 4,15Ј0,09 10±1,2

Прототип1000Я41:4569,,35 4,15iO,0910 1,5

ККС - клеточно-культуральная среда, содержащая вирус диарен (ВД). Общий белок по Лоури

1:95755,9±20,05 49,15±2,18 Структура нуклеокапсида 1184,3

сохранена и присутствует в поле зрения в большом количестве. Отмечено большое количество аирионов ВД

1:17655,219,45 9,81+1,94 В поле зрения .виден ском- 236,3

кованный нуклеокапсид,структура которого частично на.„ежи.

ПКПТ- первичная культура почек телят.

Предлагав- 1000+8,5 иый метод

,7i5,.17 5,9±0,85 ,21:38W,, 9 «iS. ,05

Прототип1000+10,81:25 9,715,17 5,ЭИ),в5 ,091:10258, 9±8,17 Н,,17

ККС - клеточно-культуральная среда, содержапав вирус инфекционного ринотрахеита (ИРТ). Опций белок по Лоури

Редактор О.Осиновых

Составитель Э.А.Макарин

Техред М.МоргенталКорректор Т.Малец

ТаблицаЭ

Таблица 11

Структура нуклеокэпсида 822,7 сохранена, количество его увеличено. Отмечено больаое иолимество ВИРИОН08 ИРТ

Отмечено значительно 260,4 меньшее количество нукле- . окапсида с частично и полностью измененной структурой