ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНОГО RATTUS NORVEGICUS, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К ВИРУСУ ГЕПАТИТА А ЧЕЛОВЕКА Российский патент 1999 года по МПК C12N5/00 C12N5/12 C12N5/16 C12N5/18 C12P21/08 

Изобретение относится к биотехнологии, точнее к медицинской вирусологии, и касается получения штамма крысиных гибридных клеток, продуцирующих моноклональные антитела (МКА) к вирусу гепатита A (ВГA), которые могут найти применение в медицине, иммунологии и биотехнологии с целью усовершенствования методов идентификации и диагностики этого опасного инфекционного заболевания человека, могут использоваться для разработки и производства нового поколения диагностических тест систем, а также для стандартизации процесса производства и разработки вакцин против ВГA.

Известны коллекции мышиных гибридом, секретирующих МКА к вирусу гепатита A, полученные как в нашей стране, так и за рубежом [1-5]. Наиболее близким к заявляемому штамму является штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus Musculus L-продуцент моноклональных антител к неизвестному нам штамму вируса гепатита A человека [4]. Для получения мышиных моноклональных антител используется гибридома мышиного происхождения, что затрудняет получение значительных количеств этих антител, так как выход асцитической жидкости от одной мыши относительно невелик 3-5 мл.

Технической задачей изобретения является получение гибридомы крысиного происхождения, обеспечивающей высокий уровень синтеза МКА к вирусу гепатита A, которые можно эффективно использовать для определения вирусного антигена или специфических иммуноглобулинов в сыворотке крови больных гепатитом A, что делает препараты этих крысиных моноклональных антител перспективными заменителями мышиных моноклональных и поликлональных антисывороток различного видового происхождения в диагностических тест-системах для обнаружения антигена вируса гепатита A и антител к нему.

Задача решается слиянием клеток крысиной миеломы 210RC.Y3-Agl.2.3. с клетками селезенки крыс LOU, иммунизированных очищенным вирусом гепатита A. Для этого штамм HAS-15/4647 ВГA культивируется в течение 3 недель на культуре клеток почки эмбриона зеленой мартышки 4647, на минимальной поддерживающей среде Игла с 2% фетальной сыворотки и очищается в градиенте плотности хлористого цезия по описанной ранее методике [6-7].

Штамм гибридных клеток 9B12 получают следующим образом. Для иммунизации используют самок крыс LOU (ГНЦ ВБ "Вектор"), массой 180-200 г (таблица).

Для слияния используют 150 млн. селезеночных клеток крыс LOU и 50 млн. клеток Y3. Смесь клеток центрифугируют, супернатант тщательно удаляют и к клеточному осадку добавляют 0,4 мл 50% раствора полиэтиленгликоля (ПЭГ) ("Merck", Германия) с молекулярной массой 2000. Смесь центрифугируют 15 мин при 600 об/мин. После 3-5 мин паузы слой ПЭГ медленно разбавляют раствором версена, после чего осадок ресуспендируют и центрифугируют. Клетки распределяют в пять 96-луночных культуральных микроплат по 100 мкл в лунку. Селекцию гибридных клеток проводят в среде НАТ, состоящей из питательной среды ДМЕМ(М), в которую добавлены 15% фетальной сыворотки коров, 0,1 мМ гипоксантина, 0,04 мМ тимидина и 0,01 мМ аминоптерина.

Отбор специфических гибридов проводят методом иммуноферментного анализа (ИФА). В лунки полистироловых микроплат ("Dynatech", Швейцария) в качестве антигена вносят 10 нг очищенного вируса гепатита A и после подсушивания на воздухе антиген фиксируют в течение 10 мин холодным этанолом. Места неспецифического связывания насыщают 1% раствором бычьего сывороточного альбумина (БСА). Затем в лунки переносят по 50 мкл культуральной среды исследуемых гибридом и инкубируют в течение часа при +37^oC. После инкубации лунки промывают 3-5 раз дистиллированной водой. Далее в платы вносят по 50 мкл антивидового коньюгата (иммуноглобулины кролика, меченные пероксидазой против IgG крысы) и сорбируют 45 мин при +37^oC. Платы промывают и проводят ферментативную реакцию. Результаты анализа регистрируют при помощи спектрофотометра, при длине волны 492 нм. Гибридный штамм 9B12 дважды клонируют методом предельных разведений и переводят в массовую культуру. Криоконсервацию проводят замораживанием 10⁷ гибридных клеток в жидком азоте в среде DMEM(M) с 10% диметилсульфоксида и 40% фетальной сыворотки.

Штамм характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки. Культура состоит из крупных округлых клеток, сходных по морфологии и размерам с исходной родительской миеломой Y-3. Овальное ядро расположено эксцентрично и занимает значительную часть цитоплазмы.

Культуральные свойства. Штамм является монослойно-суспензионной культурой, в которой до 30% клеток находятся в суспензии, не прикрепляясь к поверхности культуральной посуды. Посевная доза 100-200 тыс. клеток в миллилитре, кратность рассева - 1:5-1:6 через 3-4 дня. Индекс пролиферации - 10. Клетки с поверхности культуральной посуды удаляются энергичным встряхиванием или после обработки слоя клеток раствором версена и трипсина, в соотношении 3:1.

Стандартные условия выращивания. Среда для культивирования - среда Игла MEM в модификации Дульбекко, содержащая увеличенные количества аргинина до 200 мг/л, фолиевой кислоты до 12 мг/л, аспарагина до 36 мг/л, а также 0,05 мМ 2-меркаптоэтанола и 20 мМ HEPES. Содержание фетальной сыворотки в ростовой среде - 10%. В среду также добавляют 80 мкг/мл сульфата гентамицина.

Культивирование гибридомы в организме животного. Самок крыс LOU (ГНЦ ВБ "Вектор") сенсибилизируют внутрибрюшинным введением 5 мл вазелинового масла. Через 2-4 недели животным вводят 10 млн. гибридных клеток. Через 10-14 дней формируется асцитная опухоль. От одного животного можно получить 20-50 мл асцитической жидкости. Гибридома прививается в 100% случаев.

Характеристика полезного продукта. Методом иммунодиффузии по Оухтерлони было выяснено, что МКА относятся к классу IgG_2B. Они специфически взаимодействуют с антигеном вируса ВГA в иммуноферментном анализе (ИФА). Титр МКА в ИФА составляет 1:16000 для культуральной жидкости и 1:1024000 для асцитических жидкостей. Из 1 мл асцитической жидкости и культуральной среды выделяется при очистке 6-10 мг и 100-300 мкг специфических иммуноглобулинов соответственно. Стабильная продукция МКА сохраняется на протяжении 2-х месяцев непрерывного перевивания в культуре клеток и 10 пассажей на животных.

Криоконсервирование. Среда для замораживания - среда ДМЕМ(М) - 50%, фетальная сыворотка - 40%, диметилсульфоксид - 10%. 0,5 мл клеточной суспензии переносят в пластиковые криопробирки и помещают в пенопластовый контейнер с толщиной стенок 1,5 см. Контейнер вносят в пары жидкого азота. Через сутки пробирки переносят в жидкий азот. Размораживание проводят, опуская пробирки в воду с температурой +41^oC. Клетки разводят средой ДМЕМ(М) и центрифугируют при 600 об/мин. Осадок ресуспендируют в ростовой среде в концентрации 200-300 тыс. клеток в миллилитре и переносят в культуральные флаконы. Жизнеспособность после размораживания составляет 60-80% (окраска 0,25% трипановым синим).

Приведенные ниже примеры подробно раскрывают сущность изобретения.

Пример 1. Культивирование штамма 9B12, секретирующего моноклональные антитела к вирусу гепатита A в организме животных крыс LOU.

Вариант 1. Культивируемые клетки штамма 9B12, находящиеся в логарифмической фазе роста, стерильно центрифугируют 5-10 мин при 1000 об/мин на центрифуге ОПН-3, надосадок удаляют, а осадок суспендируют в стерильном растворе Эрла или Хенкса. Самкам крыс LOU (ГНЦ ВБ "Вектор"), весом 160-180 г, внутрибрюшинно вводят каждой по 3-5 мл клеточной суспензии, содержащей 15-20 млн. гибридных клеток. Через 7-10 дней животных усыпляют и из брюшной полости извлекают 10-12 мл асцитической жидкости. Клетки из асцитической жидкости отделяют центрифугированием и используют для дальнейшего перевивания гибридомы, а в надосадочной жидкости определяют титр антител с помощью иммуноферментного анализа, как описано выше.

Вариант 2. Предварительно крысам LOU (ГНЦ ВБ "Вектор"), весом 180-200 г, не менее чем за 10 дней до прививки гибридомных клеток вводят внутрибрюшинно по 5 мл вазелинового масла. Суспензию культивируемых клеток штамма 9B12, приготовленную, как описано выше, прививают животным внутрибрюшинно. Каждая инъекция содержит 10 млн. клеток в 1-3 мл бессывороточной среды или раствора Эрла. Через 10-14 дней после прививки гибридомных клеток образуется 15-30 мл асцитической жидкости, которая используется для получения препаратов моноклональных антител, как описано ранее.

Пример 2. Выделение очищенных моноклональных антител, продуцируемых штаммом гибридных культивируемых клеток 9B12, из асцитической жидкости и культуральной среды.

Вариант 1. Один объем асцитической жидкости или культуральной среды, содержащих МКА, разводят 4 объемами 0,6М ацетатного буфера (0,04М лимонной кислоты, 0,2М натрия ацетата), pH 4,0 и доводят pH до 4,5 с помощью 0,1N раствора едкого натра. К разведенному образцу добавляют по каплям, с постоянным перемешиванием, каприловую кислоту из расчета 25 мкл на 1 мл раствора и инкубируют 30 мин при +4^oC. Затем центрифугируют 30 мин при 8000 об/мин и удаляют осадок. Супернатант смешивают с 10-кратным фосфатно-солевым буфером (ФСБ) и устанавливают pH 7,4 раствором 1,0N едкого натра. (Супернатант при необходимости фильтруют). Добавляют равный объем насыщенного раствора сульфата аммония, встряхивают и выдерживают ночь при +4^oC или 30 мин при +20-25^oC. Центрифугируют 15 мин при 5000 об/мин. Супернатант сливают, а осадок ресуспендируют в ФСБ, pH 7,4. Остатки сульфата аммония удаляют путем диализа против 50-100 объемов ФСБ, pH 7,4.

Вариант 2. Выбранный объем асцитической жидкости, культуральной среды или очищенных каприловой кислотой МКА, в 1-кратном фосфатно-солевом буфере наносят на колонку, заполненную Sephacryl-300 ("Pharmacia", Швеция) в физиологическом растворе, содержащем трис-HCl (на 100 мл геля 2 мл белка). Элюат собирают порциями по 5 мл, вымывая иммуноглобулины физиологическим раствором pH 7,3. Фракция специфических IgG выходит в первом пике. После гельфильтрации и элюирования можно сконцентрировать фракцию, содержащую МКА, при помощи насыщенного раствора сульфата аммония или ПЭГ-20000.

Пример 3. Определение конкурентного взаимодействия МКА 9B12 с фракцией специфических IgG, выделенных из поликлональных антисывороток против вируса гепатита A, методом ИФА.

Вариант 1. Для проведения конкурентного ИФА использовалась тест-система "Вектогеп A-IgM" (ГНЦ ВБ "Вектор"), которая предназначена для выявления иммуноглобулинов класса M к вирусу гепатита A в сыворотке (плазме) крови человека методом ИФА, и может быть использована с целью ранней дифференциальной диагностики гепатита A в клинических и эпидемиологических исследованиях. В платы для иммунологических исследований (стрипы) с иммобилизованными антителами к Ig-M человека вносят контрольные положительные сыворотки крови человека (K+), содержащие анти-ВГA IgM, и отрицательную контрольную сыворотку (K-) и инкубируют при +37^oC в течение 90 мин. По истечении времени инкубации сыворотки удаляют и платы промывают 3-5 раз дистиллированной водой. Далее во все лунки платы кроме A-1 вносят 50 мкл раствора антигена и ставят в термостат на +37^oC. По окончании инкубации раствор антигена собирают и платы промывают 3-5 раз дистиллированной водой. Затем в лунках сорбируют по 50 мкл раствора конъюгата (IgG-анти-ВГA морской свинки, меченные пероксидазой хрена) и 50 мкл препаратов МКА (культуральная среда, асцитическая жидкость или очищенные гибридомные иммуноглобулины), раститрованных 2-10-кратным шагом в 1% растворе бычьего сывороточного альбумина, и инкубируют в течение 1,5 часов при +37^oC. Платы промывают и проводят ферментативную реакцию измерения оптической плотности. Результаты анализа учитывают спектрофотометрически при длине волны 492 нм. Оценка результатов. Блокирование взаимодействия специфических конъюгатов с антигеном определяется по ослаблению окрашивания в лунках в результате конкурентного связывания крысиных МКА 9B12 на антигене ВГA. За конкурентный титр принимается то разведение, где фиксируется 50%-ное уменьшение связывания конъюгата с антигеном.

Вариант 2. В лунках иммунологических плат сорбируют по 50 мкл раствора антител к ВГA (IgG-анти-ВГA морской свинки) 45-90 мин при +37^oC. По окончании сорбции лунки промывают 3-5 раз дистиллированной водой. Далее во все лунки плат вносят 50 мкл раствора антигена и ставят на 1,5 часа в термостат на +37^oC. По окончании инкубации раствор антигена сорбируют и платы промывают 3-5 раз дистиллированной водой. Затем в лунки вносят по 50 мкл препарата моноклональных антител 9B12 и раствора конъюгата антител к ВГA (IgG-анти-ВГA морской свинки, меченные пероксидазой хрена) и выдерживают 1,5 часа при +37^oC. Платы промывают 5-7 раз дистиллированной водой и проводят ферментативную реакцию. Измерение оптической плотности и оценку результатов осуществляют, как описано выше.

Конкурентный иммуноферментный анализ между поликлональными человеческими антисыворотками системы "Вектогеп A-IgM" и полученными нами МКА показал, что МКА способны на 25-70% ингибировать взаимодействие человеческих антисывороток с вирусным антигеном. Это указывает на идентичность антигенных детерминант ВГA, распознаваемых крысиными МКА и иммунными сыворотками человека.

Вышеприведенные свойства штамма гибридных клеток 9B12 позволяют заключить, что впервые на основе крысиной миеломы получена гибридома 9B12-продуцент МКА к вирусу гепатита A, которая позволяет получать крысиные моноклональные иммуноглобулины для широкого использования в научно-исследовательских и производственных целях. Клеточная линия обеспечивает получение крысиных иммуноглобулинов класса IgG_2B, в количестве 6-10 мг очищенных антител из миллилитра асцитической жидкости и 100-300 мкг из миллилитра культуральной среды.

Вышеуказанные свойства штамма 9B12 отличают его от всех описанных ранее гибридом, продуцирующих МКА к вирусу гепатита A человека.

Список используемой литературы
1. Hughes J.V., Stanton L.W., Tomassini J.E., Long W.J. and Scolnick E. M.//J. of Virol. - 1984 - v. 52, N 2 - p. 465-473.

2. Hughes J.V., Tomassini J.E., Scolnick E.M.//Hepatitis A-subunit antigen. Патент США N 4614793, МКИ C 07 N 15/04.

3. Фридлянская И.И., Чернова Т.Д., Антропова О.Ю., Кусов Ю.Ю., Насташенко Т.А., Балаян М.С., Царев С.А., Маркова С.В., Свердлов Е.Д. // Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus Musculus L. - продуцент моноклональных антител к рекомбинантному белку вируса гепатита A человека. - А.с. СССР N 1611930, МКИ C 12 N 5/00.

4. Беркова Н.П., Насташенко Т.А., Кусов Ю.Ю., Шамборант О.Г., Кожич А.Т. , Балаян М.С., Иванов В.Т. //Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus Musculus L. - продуцент моноклональных антител к вирусу гепатита A человека. - А. с. СССР N 1657527, МКИ C 12 N 5/00.

5. MacGregor A. et. al. //J. Clin. Micr. - 1984. - v. 18, N 5. - p. 1237-1243.

6. Provost P.J., Hilleman M.R. (1979) Propagation of human hepatitis A virus in cell culture in vitro. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 160, 21-221.

7. Bishop N.E., Hugo D.L., Borovel S.V., Anderson D.A. (1994) Rapid and efficient purification of hepatitis A virus from cell culture. J. Virol. Meth. 47, 203-216.

Штамм гибридных перевиваемых клеток ИМБ 612 был получен слиянием клеток крысиной миеломы 210RC.Y3-Agl.2.3 с клетками селезенки крыс LOU, иммунизированных очищенным препаратом вируса гепатита А. Штамм гибридных перевиваемых клеток ИМБ 612 секретирует моноклональные антитела IgG_2В, специфически взаимодействующие с вирусом гепатита А. Моноклональные антитела данного изобретения используют в качестве реагентов в диагностических тест-системах для обнаружения антигена вируса гепатита А и антител к нему. 1 табл.

Штамм гибридных культивируемых клеток животного Rattus norvegicus ИМБ-612, используемый для получения моноклональных антител к вирусу гепатита А человека.