СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА НА ОСНОВЕ РАСТВОРИМОГО АНТИГЕНА Российский патент 1997 года по МПК A61K39/12 

Изобретение относится к медицине, а именно к медицинской вирусологии, и предназначено для вакцинопрофилактики клещевого энцефалита.

В качестве основного средства вакцинопрофилактики инфекций, вызываемых вирусами Flavivirus семейства Flaviviridae (вирусы антигенных комплексов клещевого энцефалита, желтой лихорадки, японского энцефалита, лихорадки донго), остается использование вакцин, представляющих собой либо инактивированные (в случае использования патогенных штаммов), либо нативные (в случае использования аттенуированных штаммов) вирусосодержащие суспензии клеток различного происхождения, зараженных различными штаммами флавивирусов. Ведущим компонентом в вакцинах является вирионная фракция, которую концентрируют и очищают от белковых компонентов клеток, в которых выращивают (размножают) штаммы флавивирусов. Для усиления иммунного ответа в состав вакцин вводят в качестве адъюванта гидроокись алюминия Al(OH)₃ [4] Конечные препараты не содержат инфекционные вирусы и обеспечивают образование специфических противовирусных антител после 2 3- кратной вакцинации с интервалом 30 60 дней [9, 10, 20, 21, 24, 25, 26, 27, 28, 30, 31, 40, 41, 51]
Известный отечественный (способ 1) и зарубежный (способ 2) способы получения концентрированной и очищенной культуральной вакцины против клещевого энцефалита (КЭ).

Концентрированную и очищенную культуральную вакцину по способу 1 [23] получают путем выращивания (размножения) штамма Софьин вируса КЭ в культуре клеток ткани зеленых мартышек. На 3, 5, 7, 9 и 11 дни после заражения собирают вирусосодержащую культуральную жидкость, которую центрифугируют (30 мин при 3000 оборотах в минуту при температуре +4^oC), частично очищают микрофильтрацией в тангенциальном потоке через фильтрующие пластины с диаметром пор 450 нм и инактивируют инфекционность вируса формалином в концентрации 1:2000 (0,05% ) при +32^oC в течение 72 ч. Полученные отдельные партии инактивированной и очищенной культуральной жидкости (КЖ) хранят при +4^oC до окончания сливных КЖ, полнота инактивации вируса, микробная стерильность, отсутствие посторонних патогенов), объединяют в серию и проводят заключительную стерилизацию через каскад мембранных фильтров с диаметром пор от 1200 800 450 до 300 нм. Готовые серии инактивированной культуральной вакцины КЭ сорбируют на гидроокиси алюминия, добавляя Al(OH)₃ до концентрации 0,2% или высушивают с соответствующим наполнителем. Трехкратная вакцинация лабораторных мышей обеспечивала защиту животных при заражении 200 LD₅₀ со значениями индекса резистентности 5,0 7,0.

Концентрированную и очищенную культуральную вакцину по способу 2 [38] получают путем выращивания (размножения) вируса КЭ в клетках эмбрионов кур при анаэробных условиях при температуре +25 38^oC в течение 1 5 дней. Затем клетки и остатки клеток отделяют путем центрифугирования при 3000 оборотов/мин в течение 15 минут при +4^oC. Полученную суспензию вируса инактивируют формалином в концентрации 1:2000 (0,05%) в течение 30 минут при +37^oC или 48 ч при комнатной температуре. Затем инактивированную суспензию вируса смешивают с протаминсульфатом в концентрации 0,5 мг/л и выдерживают в течение ночи при +4^oC. Образовавшийся осадок отделяют посредством центрифугирования при 10000 оборотов/мин в течение 30 минут при +4^oC. Полученная описанным способом суспензия представляет собой исходный материал для очистки методом непрерывного ультрацентрифугирования в градиенте плотности сахарозы. Суспензию со скоростью потока 3 л/ч пропускают с помощью насоса через проточный ротор с градиентом сахарозы 0 50% при скорости вращения ротора 35000 оборотов/мин. После прохождения всей суспензии центрифугу останавливают и содержимое ротора разделяют на фракции. В каждой фракции определяют экстинкцию при 260 нм и одновременно определяют концентрацию сахарозы. Наибольшая концентрация вируса по экстинкции выявляется во фракциях с 40%-ным раствором сахарозы. Содержащие вирус фракции разбавляют буфером, содержащим 0,1% альбумина человека, и затем перерабатывают далее в вакцину обычным способом, добавляя гидроокись алюминия Al(OH)₃ до концентрации 0,2% Способ позволяет повысить частоту и стабильность вакцины, которая обеспечивает защиту двукратно вакцинированных лабораторных мышей при заражении 100 1000 LD₅₀.

Недостатком известных вакцин против КЭ и других флавивирусов остается их недостаточный защитный эффект [9, 12, 13, 14, 36]
Для вируса КЭ и других флавивирусов был описан медленно седиментирующий вирусспецифический антиген, обладающий комплементсвязывающей активностью, не связанный с фракцией вирионов, не обладающий инфекционностью и гемагглютинирующей активностью, который был назван "растворимым" антигеном (РА). Этот антиген сохраняет свои иммунологические свойства при воздействии 0,1% лаурилсульфата натрия, 0,1% 2-мераакптоэтанола, 8М мочевины, прогревания при 100^oC, тогда как другие белки вирионов деградируют и теряют биологические свойства [2, 3, 4, 6, 15, 29, 32, 48, 49] Было показано, что РА состоит из неструктурных белков, антитела к которым обладают защитным (протективным) действием [5, 7, 16, 37, 46, 50, 51] Были получены генно-инженерные вакцинные препараты против ряда флавивирусов на основе экспрессии неструктурных белков флавивирусов через геномы рекомбинантных штаммов вирусов и бактерий. Полученные вакцинные препараты обладали хорошей протективной активностью при заражении лабораторных животных летальными дозами флавивирусов [1, 22, 33, 42, 43, 44] Перечисленные свойства РА, в том числе вируса КЭ, позволяют использовать его для получения вакцины с высокими протективными свойствами. Высокая резистентность к денатурирующему действию физико-химических факторов, в частности к воздействию мочевины, позволяет выделять РА путем химической деградации сахарозо-ацетонового антигена вируса КЭ при воздействии 8М мочевины.

Сущность изобретения заключается в использовании "растворимого" антигена вируса КЭ для приготовления вакцины против КЭ.

Целью изобретения является повышение защитных свойств вакцины против клещевого энцефалита. Предлагаемую вакцину против клещевого энцифалита на основе "растворимого" антигена вируса КЭ можно получить следующим образом. Неструктурные белки вируса КЭ, содержащиеся в "растворимом" антигене, конъюгируют с гранулами коллоидного золота с последующим использованием полученного конъюгата в качестве вакцины против КЭ.

Известны методы получения коллоидного золота, которое представляет собой отрицательно заряженный гидрофобный золь, состоящий из гранул золота. Коллоидное золото получают восстановлением золотохлористоводородной кислоты (HAuCl₄), при этом, в зависимости используемых для восстановления агентов, можно получать гранулы золота заданных размеров в диапазоне от 3 до 60 нм. При изучении взаимодействия коллоидного золота с белками установлено, что при соответствующих значениях pH и концентрации белков происходит нековалентное и электростатичное связывание молекул белков с гранулами золота. Полученные конъюгаты коллоидного золота с белками стабильны, молекулы белков сохраняют сои биологические свойства [34, 35, 49, 45, 47]
Приведенные ниже сведения, подтверждающие возможность изобретения, были получены с использованием перечисленных материалов и методов.

Реактивы:
Вода бидистиллированная (H₂O), требования ГФ-Х, с. 107.

Золотохлористоводородная кислота 47,85% 4 водная (HAuCl₄), ТУ 6-09-2237-76.

Калий углекислый (K₂CO₃), осч 15-2, ТУ 6-09-588-75.

Натрий лимоннокислый трехзамещенный (C₆H₅Na₃O₇•3H₂O) чда, ГОСТ 22280-77. Цитрат натрия.

Натрий хлористый (NaCl), осч 6-4, ТУ 6-09-3658-74.

Едкий натрий (NaOH), ГОСТ 4328-48.

Полиэтиленгликоль (ПЭГ) с молекулярным весом 20000, Loba Chemie (Австрия).

Соляная кислота (HCl), осч 7-4, ГОСТ 14261-77.

Однозамещенный фосфорнокислый натрий (NaH₂PO₄•2H₂O), хч, ГОСТ 245-76.

Двухзамещенный фосфорнокислый натрий (Na₂HPO₄•12H₂O), хч, ГОСТ 4172-76.

Борная кислота (H₃BO₃), ГОСТ 18704-78.

Натрий тетраборнокислый (Na₂B₄O₇•10H₂O), осч 3-4, ТУ 6-09-3970-75.

Веронал (C₈O₃N₂H₁₂), ГФ-1Х-56.

Мединал (C₈O₃N₂H₁₁Na), ГФ-1Х-57.

Хлористый кальций (CaCl₂), хч, ГОСТ 4141-48.

Хлористый магний (MgCl₂•6H₂O), хч, ГОСТ 4299-48.

Ацетон (C₃H₆O), хч, ГОСТ 6-09-3513-82.

Трис-(оксиметил)-аминометан (C₄H₁₁O₃N), ч, ТУ 6-09-4292-76,
Альбумин бычий сывороточный сухой, ТУ 10П-34-62.

Сахароза, чда, ГОСТ 5833-54.

Борная кислота (H₃BO₃), ГОСТ СТ27/1830.

Натрия азид (NaN₃), производство фирмы "SERVA" (Германия).

Буферные растворы (готовят на дистиллированной воде):
1. 0,01 М фосфатно-солевой буферный раствор (ФСБ), pH 7,4. Готовят следующим образом: 23 мл 0,01 М раствора NaH₂PO•2H₂O соединяют с 77 мл 0,01 М раствора Na₂HPO•12H₂O и затем к ним добавляют 872 мг NaCl, после чего проверяют pH раствора на потенциалометре и выравнивают до значения 7,2 7,4.

2. Вероналовый буфер для реакции связывания комплемента, pH 7,3 7,4. Готовят основной концентрированный раствор следующим образом: в 500 мд дистиллированной воды растворяют 85,0 г NaCl; 1,68 г MgCl₂•6H₂O; 0,28 г CaCl₂; 3,75 г мединала; 5,75 г веронала, затем общий объем доводят до 2 л дистиллированной воды. Рабочий раствор готовят, соединяя 1 объем концентрированного раствора с 4 объемами дистиллированной воды.

3. Боратный буферный раствор (ББР), pH 9,0: растворяют 3,15 г H₃BO₃ в 200 мл горячей дистиллированной воды, затем добавляют 8,8 г NaCl и 0,96 г NaOH, после растворения компонентов раствор охлаждают и добавляют объем до 1,0 л дистиллированной водой.

4. Растворы для получения коллоидного золота и его конъюгирования с "растворимым" антигеном:
боратно-альбуминовый трис буфер (БА-трис буфер) для ресуспендирования и хранения вакцины, pH 8,2. На дистиллированной воде готовят раствор компонентов в указанных концентрациях: 0,1% альбумин бычий сывороточный, 20 mM трис-(оксиметил) аминометан, 20 mM NaN₃, 150 mM NaCl;
0,2 М раствор K₂CO₃ готовят непосредственно перед использованием;
10%-ный раствор NaCl готовят непосредственно перед использованием;
1% -ный раствор полиэтиленгликоля с молекулярным весом 20000 (ПЭГ 20000) готовят непосредственно перед использованием;
0,1 N раствор HCl готовят непосредственно перед использованием;
0,01%-ный раствор HAuCl₄ готовят непосредственно перед использованием;
2 mM раствор Na₂B₄O₇•10H₂O, pH 9,0 готовят непосредственно перед использованием;
0,15 M раствор NaCl (физиологический раствор) использовали после стерилизации автоклавированием.

Биологические препараты:
"Вакцина клещевого энцефалита культуральная сорбированная инактивированная жидкая", производства НПО "ВИРИОН" (г. Томск) коммерческая вакцина;
"Диагностикум клещевого энцефалита сухой для РТГА, РСК, РРГ, РТНГА", производства НПО "ВИРИОН" (г. Томск);
"Комплемент сухой", производства НПО "ВИРИОН" (г. Томск);
"Сыворотка гемолитическая жидкая", производства Пермского НИИ вакцин и сывороток.

Оборудование:
Электроплитка бытовая с закрытыми спиралями.

pH-метр любой марки.

Водяная баня любой марки.

Холодильник бытовой любой марки.

Центрифуга рефрижераторная любой марки с горизонтальным и угловым роторами с ускорением не менее 60000 g.

Прозрачные пластиковые центрифужные пробирки, которые выдерживают ускорение не менее 60000 g.

Весы аналитические или торсионные любой марки.

Колбы конические емкостью 50, 100, 250 мл, ГОСТ 8634-57.

Пипетки градуированные на 1, 2, 5, 10 мл, ГОСТ 20292-74.

Цилиндры мерные на 25, 50, 100 мл, ГОСТ 1770-74.

Вариопипетки центрифужные, ГОСТ 7774-55.

Пробирки пластиковые для проб на 1,5 5,0 мл любой марки.

Вакуумный насос марки с системой обеззараживания выходящего воздуха.

Планшеты для иммунологических реакций, ТУ 64-2-278-79.

Спектофотометр любой марки.

Методы.

В настоящей работе использовали известные серологические и биологические методы [8, 17, 52]
Приготовление "растворимого" антигена (РА). "Растворимый" антиген готовили из сахарозо-ацетонового антигена (САА) следующим образом. Лабораторных белых мышей 3 4- дневного возраста заражали путем внутримозгового введения 1000 LD_50/0,03мл вирусосодержащей суспензии штамма Софьин вируса КЭ. На 3 4 день после заражения, при выраженной клинической картине заболевания, мышей под общим наркозом обескровливали и в асептических условиях у них извлекали мозговую ткань. Далее проводили сахарозо-ацетоновую экстракцию вирусных антигенов. Для этого готовили 20%-ную суспензию ткани мозга на 8,5%-ном охлажденном растворе сахарозы, приготовленном на дистиллированной воде, добавляя по 0,4 мл раствора сахарозы на 1 мозг. После этого полученную суспензию ткани мозга добавляли к охлажденному до -15^oC ацетона из расчета 1 объем мозговой суспензии на 20 объемов ацетона. Полученную смесь центрифугировали 20 мин при 1500 об/мин, надосадочную жидкость молочного цвета удаляли, а к осадку добавляли первоначальный объем охлажденного ацетона. Осадок разбивали стеклянной палочной до образования гомогенной смеси и оставляли на 1 ч в ледяной бане, периодически перемешивая. Затем вновь центрифугировали 20 мин при 1500 об/мин, надосадочную жидкость удаляли, к осадку добавляли небольшое количество охлажденного ацетона и вновь центрифугировали в том же режиме. Надосадочную жидкость удаляли, а осадок высушивали под вакуумом.

К полученному сухому осадку добавляют боратный буферный раствор (ББР) с pH 9,0 из расчета 0,5 мл на 1 мозг, гомогенизируют стеклянной палочкой и оставляют для экстракции на 18 20 ч при +4^oC. После этого суспензию центрифугируют 1 ч при скорости 10 тыс. об/мин, надосадочную жидкость собирают и используют в качестве сахарозо-ацетонового антигена, предварительно определяя титры в реакции связывания комплимента. "Растворимый" антиген вируса КЭ получали путем обработки сахарозо-ацетонового антигена (САА) 8 M мочевиной по методу [4, 6] Для этого готовят навески мочевины для получения ее 8 M концентрации в растворе: 480 мг мочевины на 1 мл САА. Затем наливают в пробирку строго определенный объем САА, пробирку на 1/3 погружают в водяную баню при +37^oC и в пробирку высыпают навеску мочевины, после чего раствор интенсивно пипетируют до полного растворения мочевины. После растворения мочевины пробирку закрывают пробкой и оставляют в водяной бане при +37^oC на 2 ч. После этого путем диализа проводят очистку полученного "растворимого" антигена от мочевины. Для этого раствор из пробирки переносят в вискозные мешочки и диализуют против 100 объемов борного буферного раствора (pH 9,0) в течение 18 ч при +4^oC. По окончании диализа раствор из диализных мешочков переносили в одну пробирку и испытывали на биологическую безопасность (отсутствие инфекционной активности), а затем определяли титры "растворимого" антигена в реакции связывания комплемента.

Перед проведением конъюгирования с коллоидным золотом приготовленный "растворимый" антиген вируса КЭ помещают в вискозный мешочек и диализуют в течение 18 ч при +4^oC против 100 объемов mM раствора тетраборнокислого натрия (pH 9,0). После этого "растворимый" антиген снимают с диализа, определяют концентрацию белка в нем и используют для получения конъюгатов с коллоидным золотом.

Приготовление коллоидного золота. Коллоидное золото с диаметром частиц - 15 нм получали следующим образом. Из 47,85% 4-водной золотохлористоводородной кислоты в стеклянной колбе готовят 100 мл 0,01%-ный водный раствор HAuCl₄, доводят до кипения и добавляют 3,0 мл 1%-ного водного раствора цитрата натрия. Раствор кипятят на медленном огне 15 20 мин, при этом раствор приобретал красно-оранжевый цвет. После остывания раствора в него добавляют 0,2 M K₂CO, доводя значения pH 9,0. Для этого брали небольшую аликвоту полученного раствора коллоидного золота, в которую добавляли навеску сухого ПЭГ 20000, исходя из концентрации 1% Эту часть раствора использовали для доведения значения pH на потенциометре, добавляя капельно в раствор коллоидного золота 0,2 M раствор K₂CO₃. Затем в основной объем раствора коллоидного золота добавляли 0,2 M раствор K₂CO₃ в объеме, пропорциональном объемным соотношением аликвоты раствора коллоидного золота и основного объема раствора коллоидного золота (пример: аликвоту коллоидного золота объемом 10,0 мл с 1% ПЭГ 20000 доводят до pH 9,0, добавляя по каплям 150 мкл 0,2 M раствора K₂CO₃. Исходя из объемных соотношений аликвоты и основного объема раствора коллоидного золота, к 100,0 мл основного объема раствора коллоидного золота добавляют 1,5 мл 0,2 M раствора K₂CO₃). При смещении pH более 9,0 в основном объеме раствора коллоидного золота его закисляют 0,1 N раствором HCl. Готовый раствор коллоидного золота используют сразу для получения конъюгатов.

Приготовление конъюгатов коллоидного золота и "растворимого" антигена. Перед конъюгированием на 0,01 M ФСБ готовят 2 мл "растворимого" антигена с концентрацией белка 1,2 мг/мл, который используют для определения точки стабилизации (определение оптимальной концентрации "растворимого" антигена, необходимой для образования стабильных комплексов с коллоидным золотом. Для определения точки стабилизации готовили по 0,1 мл двухкратные разведения "растворимого" антигена на 0,01 М ФСБ, начиная с концентрации 1,2 мг/мл. После чего к 0,1 мл разведений "растворимого" антигена добавляли 0,5 мл раствора коллоидного золота встряхивали и через одну минуту добавляли 0,1 мл 10% -ного раствора хлористого натрия. В пробах с достаточной концентрацией белка цвет раствора остается красно-оранжевым или приобретает лилово-красный оттенок. Минимальная для стабилизации комплексов концентрация белка РА содержится в той пробе, цвет раствора которой имеет красно-оранжевый или лилово-красный, а в следующей за ней робе раствор имеет слабо-синюю или фиолетовую окраску. Расчет оптимальной концентрации проводят, увеличивая на 10% значение минимальной концентрации (пример: минимальная концентрация белка равна 18,7 мкг/мл, исходя из приведенного выше расчета находим, что оптимальная концентрация равна сумме минимальной концентрации и значению 10% от нее, т. е. около 20,6 мкг/мл). После определения точки стабилизации к раствору "растворимого" антигена добавляют раствор коллоидного золота в необходимом объеме (пример: точка стабилизации соответствует концентрации белка 24 мкг/мл, следовательно, для стабилизации 100 мл коллоидного золота необходимо 2,4 мг белка РА. Исходя из расчетов, к 2 мл "растворимого" антигена с концентрацией 1,2 мг/мл медленно добавляют 100 мл коллоидного золота). Через 2 мин к конъюгату добавляют 1%-ный раствор ПЭГ 20000 из расчета 1 мл раствора ПЭГ 20000 на 20 мл конъюгата, т.е. в данном случае 5 мл раствора ПЭГ 20000. Для удаления не связавшегося с частицами золота белка РА и агрегатов коллоидного золота полученный конъюгат центрифугируют обязательно в угловом роторе при 60000 g в течение 60 мин в прозрачных пластиковых пробирках на рефрижераторной центрифуге при +4^oC. По окончании центрифугирования оценивают качество полученного конъюгата. Если надосадочная жидкость прозрачная, на нижней трети боковой стенки пробирок равномерное, усиливающееся книзу, расположение кристаллов темно-красного цвета и густая темно-красная суспензия на дне пробирок, то конъюгат считают пригодным. В этом случае надосадочную жидкость удаляют, суспензию со дна пробирок переносят в чистые пробирки и ресуспендируют в исходном объеме БА-трис буфере (pH 8,2) и затем повторяют центрифугирование в аналогичном режиме. По окончании второго центрифугирования весь процесс, описанный выше, повторяют. После третьего центрифугирования супернатант отбрасывают, суспензию со дна пробирок переносят в пластиковые пробирки и ресуспендируют в 1/100 исходного объема в БА-трис буфере (pH 8,2). Полученный конъюгат хранили при +4^oC и использовали в качестве экспериментальной вакцины в течение 30 дней.

Определение концентрации белка. Концентрации белка в "растворимом" антигене определяли на спектрофотометре СФ-26, измеряя значение оптической плотности раствора при длине волны 280 нм. Расчет концентрации суммарного белка определяли по калибровочной кривой.

Серологические реакции.

Реакция связывания комплемента (РСК). РСК ставили микрометодом в 96-луночных пластиковых панелях с U-образным дном по общепринятому методу. Для РСК использовали коммерческие наборы диагностикума клещевого энцефалита, комплемента, гемолитической сыворотки. Для постановки РСК использовали эритроциты барана, которые выделяли центрифугированием из дефибринизированной крови барана. Для растворения и разведения ингредиентов РСК использовали рабочий раствор вероналового буфера (pH 7,3 7,4). Гемолитическую систему для РСК готовят за 15 мин до употребления в объеме, необходимом для работы. Гемолитическая система представляет собой смесь равных объемов 2%-ной суспензии эритроцитов барабана и гемолитической сыворотки, взятой в троекратном титре (например: на этикетке ампулы с гемолитической сывороткой указан титр 1 1200, в работу берут разведение 1 400), смесь сенсибилизируют 15 мин в термостате при +37^oC. Специфическую сыворотку перед реакцией разводили 1 10 и прогревали в водяной бане 30 мин при +60^oC.

Постановку РСК начинали с титрования комплемента. Для этого готовили начальное разведение комплемента 1 50 и из этого раствора готовили последовательные разведения по следующей схеме; приведенной в таблице 1.

После этого из пробирок переносят по 0,3 мл каждого разведения комплемента, начиная с наибольшего, добавляют к ним по 0,1 мл вероналового буфера и по 0,2 мл гемолитической системы. Пробирки встряхивают и помещают на 30 мин в водяную баню при +37^oC. В качестве контроля в отдельной пробирке смешивают 0,2 мл гемолитической системы и 0,4 мл вероналового буфера. Затем по степени гемолиза эритроцитов определяют активность комплемента. За 1 единицу активности комплемента принимают то наибольшее разведение комплемента, при котором происходит полный гемолиз. В работу берут 2,0 единицы комплемента (пример: если полный гемолиз при титровании комплемента выявлен в 7 пробирке, то для работы используют разведение комплемента, содержащееся в 3 пробирке).

Основной опыт РСК ставили следующим образом: готовили в пробирках 2-кратные разведения антигена (САА или "растворимый" антиген, коммерческий антиген вируса КЭ) до 1 1280, меняя после каждого разведения пипетку, затем по 1 капле (0,025 мл) каждого разведения антигена, начиная с большего, переносили в лунки 96-луночной панели. К каждому разведению антигена добавляли 1 каплю специфической сыворотки в рабочем разведении, указанном на этикетке ампулы, 2 капли комплемента в рабочем разведении. Одновременно в каждом опыте ставили следующие контрольные пробы:
на антикомплементарность: контроль антигена (1 капля антигена, 1 капля вероналового буфера и 2 капли комплемента); контроль специфической сыворотки (1 капля сыворотки, 1 капля вероналового буфера и 2 капли комплемента);
контроль специфичности сыворотки (1 капля коммерческого антигена вируса КЭ в рабочем разведении, указанном на этикетке ампулы, 1 капля специфической сыворотки в рабочем разведении, указанном на этикетке ампулы, 2 капли комплемента).

Панели встряхивают, закрывают крышками и помещают в холодильник на 18 ч при +4^oC. По истечении времени панели извлекают из холодильника, снимают крышки и в каждую лунку переносят по 2 капли гемолитической системы. При этом ставят дополнительный контроль на спонтанный гемолиз эритроцитов (2 капли вероналового буфера, 2 капли комплемента, 2 капли гемолитической системы). Панели встряхивают и переносят в термостат при +37^oC на 30 минут. Результаты реакции учитывают только после полного гемолиза эритроцитов в контролях на антикомплементарность и отсутствия гемолиза в контролях на спонтанный гемолиз эритроцитов. За титры антигенов принимают те разведения антигенов, в пробах с которыми не происходит гемолиз эритроцитов.

Биологические методы.

Метод контроля биологической безвредности "растворимого" антигена. Каждой из 30 лабораторных белых мышей массой 10 12 г интрацеребрально вводили 0,03 мл "растворимого" антигена. Животных наблюдали 14 дней. На 15 день у мышей под наркозом в асептических условиях извлекали мозговую ткань и готовили 10% -ную суспензию на 0,15 М растворе NaCl. Суспензию мозговой ткани центрифугировали 15 мин при 1500 об/мин и после этого надосадочную жидкость интрацеребрально вводили в объеме 0,03 мл каждой из 30 лабораторных белых мышей массой 10 12 г. Животных наблюдали в течение 14 дней. Если в процессе наблюдения за животными первой и второй групп не отмечали гибель ни одного животного, "растворимый" антиген считали биологически безвредным.

Определение инфекционной активности вируса. Прототипный штамм Софьин вируса КЭ перед использованием в экспериментах титровали, определяли LD₅₀. Для этого готовили 10-кратные разведения 10%-ной вирусосодержащей суспензии мозговой ткани зараженных новорожденных лабораторных белых мышей. Для титрования инфекционной активности вируса КЭ готовили разведения от 10^-2 до 10^-10. Титрование вируса проводили на лабораторных белых мышах массой 10 12 г, определяя инфекционную активность при центральном (внутримозговом -i/с) пути заражения в объеме 0,03 мл. Зараженных животных наблюдали 21 день. Расчет значений LD₅₀ производили методом Кербера [18, 19] Для биологических реакций использовали 100 LD50, 1000 LD₅₀ и 10000 LD₅₀ (пример: при титровании инфекционной активности штамма Софьин определено, что 1 LD_50/0,03мл содержится в разведении вирусосодержащей суспензии 10^-9. Исходя из этого, определяем, что 100 LD₅₀, 1000 LD₅₀ и 10000 LD₅₀ содержатся, соответственно, в разведениях 10^-7, 10^-6 и 10^-5).

Вакцинация лабораторных животных.

Контрольная группа. Каждой лабораторной белой мыши массой 4 6 г в группе из 65 мышей вводили i/p коммерческую вакцину в объеме 0,1 мл, разведенную стерильным 0,15 М NaCl, из расчета 36 мкг вирусного белка на 1 животное. На 7 и 21 дни этим же мышам i/p вводили коммерческую вакцину из расчета 32 мкг белка в вакцине на 1 животное.

Экспериментальные группы. Формировали три группы по 65 лабораторных белых мышей массой 4 6 г. Каждой мыши из первой группы i/p вводили экспериментальную вакцину серии N 1 (конъюгат коллоидного золота и "растворимого" антигена) в объеме 0,1 мл, разведенную стерильным 0,15 M NaCl, из расчета 32 мкг белка на 1 животное. На 7 и 21 дни этим же мышам i/p вводили экспериментальную вакцину в том же объеме и в той же концентрации белка. Аналогичным образом вакцинировали мышей во второй и третьей экспериментальных группах, используя для этого экспериментальную вакцину серии N 2 и серии N 3.

Сыворотка крови. На 7 день после первой вакцинации и на 28 день после третьей вакцинации у 10 мышей в каждой контрольной и экспериментальных группах, перед вакцинацией, в асептических условиях под общим наркозом из супраорбитального синуса брали кровь и после ретракции сгустка крови отделяли центрифугированием сыворотку. Пробы сыворотки крови животных каждой группы объединяли и до использования хранили в закрытых пробирках при -70^oC. Перед использованием в биологических реакциях сыворотку крови размораживали, готовили разведения сыворотки 1:10 на стерильном 0,15 М растворе NaCl и прогревали 20 мин при +60^oC.

Протективная активность вакцин.

Протективную активность вакцин определяли на контрольной и экспериментальных группах лабораторных белых мышей после завершения трехкратной вакцинации. На 28 день мышей во всех группах заражали путем внутримозгового введения вирусосодержащей суспензии штамма Софьин, содержащий 100 LD_50/0,03мл и 1000 LD_50/0,03мл. Одновременно заражали невакцинированных мышей того же возраста, что в опытных группах, путем внутримозгового введения вирусосодержащей суспензии штамма Софьин, содержащей 100 LD_50/0,03мл и 1000 LD_50/0,03мл. Каждая группа изначально состояла из 10 15 лабораторных белых мышей, которых наблюдали в течение 21 дня от момента заражения. Протективную активность вакцин оценивали по:
среднему времени выживания мышей, которое представляет собой среднее арифметическое число дней, прожитых мышами в экспериментальной и контрольных группах;
коэффициенту защиты, который представляет собой процентное выражение числа выживших животных по отношению к общему числу зараженных животных.

Терапевтическая активность антител.

Терапевтическую активность антител, индуцированных вакцинами у вакцинированных животных, определяли на лабораторных белых мышах массой 10 - 12 г (экспериментальные группы), которых заражали внутримозговым введением вирусосодержащей суспензии, содержащей 100 LD_50/0,03мл, 1000 LD_50/0,03мл и 10000 LD_50/0,03мл. Одновременно аналогичным образом заражали 10 12- граммовых мышей контрольной группы. Через 24 ч мышам экспериментальных групп интраперитониально вводили по 0,1 мл прогретой сыворотки крови вакцинированных мышей, разведенной 1: 10 стерильным раствором 0,15 М NaCl. Одновременно мышам контрольной группы интраперитониально вводили по 0,1 мл прогретой сыворотки крови невакцинированных мышей (нормальная сыворотка), разведенной 1:10 стерильным раствором 0,15 М NaCl. Каждая группа (экспериментальные и контрольная) мышей состояла из 10 15 животных. Терапевтическую активность антител оценивали по среднему времени выживания животных.

Статистическую обработку полученных данных производили общепринятыми методами [11]
Примеры, подтверждающие возможность осуществления изобретения.

Из мозга зараженных штаммов Софьин лабораторных белых мышей трех отдельных групп (I, II, III) приготовлено по 3 мл САА. При тестировании в РСК установлено, что САА этих групп имеет титры в диапазоне 1:320 1:640. Приготовленный САА трех групп обработан 8 М мочевиной, в результате получен "растворимый" антиген (РА) трех серий РАI, РАII, РАIII. Установлено, что PA этих серий не обладал инфекционностью. Суммарный белок в сериях РА определялся в диапазоне 10,6 11,0 мг/мл: концентрация для серии РАI составила 10,6±0,12 мл/мл, серии РАII 10,9±0,14 мл/мл, для серии РАIII - 11,0±0,11 мг/мл. В РСК титр серии РА I равен 1:40, серии РАII 1:80, серии РАIII 1:40. Методом восстановления золотохлористоводородной кислоты цитратом натрия приготовлено три отдельных пробы по 100 мл суспензии коллоидного золота (СКЗ) с диаметром частиц 15 нм. Определено, что в пробе СКЗ N 1 его стабилизация "растворимым" агентом происходит при концентрации белка в 40,0±0,6 мкг/мл, в пробе СКЗ N 2 41,0±0,5 мкг/мл, в пробе СКЗ N 3 40,0±0,5 мкг/мл. Для приготовления конъюгатов трех разных проб коллоидного золота и трех разных серий "растворимого" антигена вируса КЭ (РАI и СКЗ N1, РАII и СКЗ N2, РАIII и СКЗ N 3) использовали РА в концентрации 45 мкг/мл. Было приготовлено три серии (N 1, N 2, N 3) экспериментальной вакцины, в которых конечную концентрацию конъюгированного РА доводили до 4,5 мг/мл. После этого провели сравнительное изучение протективных свойств коммерческой и экспериментальной вакцин. Протектную активность вакцин и терапевтическую активность индуцированных ими антител изучили по описанным выше методам после 1-кратной и 3-кратной вакцинации животных. Полученные в экспериментах результаты изучения протективной активности вакцин представлены в таблице N 2. Как можно видеть, в группах животных после заражения в дозе 100 LD₅₀, в сравнении с контрольной (невакцинированной) группой животных, наблюдалось увеличение среднего времени выживания: у животных, вакцинированных коммерческой вакциной, от 5,3 до 15,4 дней (P<0,005), а у животных, вакцинированных экспериментальной вакциной, от 5,3 до 174,1 дней (P<0,005). В группах животных, зараженных в дозе 1000 LD₅₀, увеличение среднего времени выживания у мышей, вакцинированных коммерческой вакциной, составило от 4,7 до 13,0 дней (P, 0,005), а у вакцинированных экспериментальной вакциной - от 4,7 до 17,1 дней (P <0,005) в сравнении со средним временем выживания у мышей в контрольной группы. Среднее время выживания у животных, вакцинированных экспериментальной вакциной, на 10 30% выше аналогичного показателя у животных, вакцинированных коммерческой вакциной. При сравнении коэффициента защиты в группах животных, инфицированных 100 LD₅₀, этот показатель на 19 24% выше в группах, вакцинированных экспериментальной вакциной, в сравнении с группой, вакцинированной коммерческой вакциной. В группах животных, зараженных 1000 LD₅₀, коэффициент защиты животных выше на 12,4 23,4% в группах, вакцинированных экспериментальной вакциной, по сравнению с животными, вакцинированными коммерческой вакциной. Представленные результаты показывают, что защитные свойства предлагаемой экспериментальной вакцины в -1,3 1,5 раз выше защитных свойств используемой нами для сравнения коммерческой вакцины против КЭ.

Результаты сравнения изучения терапевтической активности антител, индуцированных коммерческой и экспериментальной вакцинами после 1- и 3-кратных вакцинаций, представлены в таблице 3. Представленные результаты показывают, что более выраженным терапевтическим эффектом обладают антитела, индуцированные экспериментальной вакциной. В наших экспериментах наблюдалось увеличение среднего времени выживания у животных, которым вводили антитела от однократно и трехкратно вакцинированных экспериментальной вакциной мышей, в сравнении с животными, которым вводили антитела от однократно и трехкратно вакцинированных коммерческой вакциной. В группах животных, которым вводили сыворотку крови от однократно вакцинированных мышей, наблюдали увеличение среднего времени выживания: от 8,1 до 12,8 дней ( P<0,005 ) при заражении 100 LD₅₀; от 6,7 до 10,4 дней ( P<0,005 ) при заражении 1000 LD₅₀; от 6,0 до 7,3 дней ( P < 0,005 ) при заражении 10000 LD₅₀. В группах животных, которым через 24 ч после заражения вводили антитела от трехкратно вакцинированных мышей, также наблюдали увеличение среднего времени выживания у животных, которым вводили экспериментальную вакцину: от 8,5 до 14,4 дней (P < 0,005) при заражении 100 LD₅₀; от 7,3 до 9,6 дней (P <0,005) при заражении 1000 LD₅₀; от 6,6 до 7,8 дней (P <0,005) при заражении 10000 LD₅₀. Представленные результаты опытов сравнения свидетельствуют о способности экспериментальной вакцины индуцировать антитела, терапевтическая эффективность которых в -1,3 1,4 раза выше антител, индуцированных коммерческой вакциной.

Таким образом, использование "растворимого" антитела вируса КЭ, конъюгированного с гранулами коллоидного золота, позволяет получить вакцину против клещевидного энцефалита. Полученная согласно предложенному способу вакцина отличается более высокими протективными свойствами. Представленные сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения, свидетельствуют о существенных признаках, отличительных от известных прототипов.

Литература, используемая при составлении описания
1. Беляев А.С. Хромых А.А. Путинцева Н.И. и др. Рекомбинанты вируса осповакцины и вируса клещевого энцефалита. //Генно-инж. и синтетич. вакцины. Пущино, 1990, с. 54-58.

2. Верета Л.А. Левкович Е.Н. Некоторые результаты и перспективы использования метода ионообменной хроматографии при изучении штаммов вируса клещевого энцефалита. //Материалы XV научной сессии Института полиомиелита и вирусных энцефалитов АМН СССР. М. 1968, с. 9.

3. Gaidamovich S. Ya. Lavrova N.A. Soluble antigen of West Nile virus. //Acta virol. 1973. V.17. P.513.

4. Gaidamovich S.Ya. Demenev V.A. Obukhova V.R. Differentiation in the somplement fixation test of the viruses of tick-borne encephalitis complex by means of a type-specific soluble antigen. //Acta Virol. 1985. V.29. N 2. P. 143 149.

5. Грицун Е. С. Ляпустин В.Н. Шаталов А.Г. Лашкевич В.А. Множественные формы белка NS1 как основного компонента невирионного ("растворимого") антигена вируса клещевого энцефалита. //Вопр. вирусол. 1990, N 6, с. 471 - 474.

6. Деменев В.А. Индикация методом имуэлектронной микроскопии и типирование по растворимому антигену вирусов комплекса клещевого энцефалита, //Автореф. канд. диссерт. М. 1984, 26 с.

7. Деменев В. А. Гайдамович С.Я. Рослая И.Г. и др. Выделение штаммов вируса Негиши в Хабаровском крае. //Вопр. вирусол. 1987, N.1, с. 105 108.

8. Дерябин П.Г. Лебедева Г.А. Логинова Н.В. Реакция нейтрализации тогавирусов на мышах и культурах. //Арбовирусы. М. 1986, с. 120 126.

9. Дубов А.В. Пути усовершенствования системы вакцинопрофилактики клещевого энцефалита. //Труды Ленинградского НИИ эпидемиол. и микробиол. 1989, 65, с. 120 125.

10. Dzagurov S.G. Vorobieva M.S. Shalamberidze T.D. et al. Immune response to different tick-borne encephalitis vaccines as revealed by lymphocyte bldast transformation and virus neutralization best //Acta virol. - 1984. V. 28. N 5. P. 388 394.

11. Кабатов Ю.ф. Славин М.В. Вероятностно-статистические методы в медицинских исследованиях и надежность медицинской аппаратуры. М. 1976, с. 5 156.

12. Лебедев В.И. Антонова А.М. Чистофорова Г.А. и др. Эпидемиологические особенности и проблемы профилактики клещевого энцефалита в Иркутске. //Современные проблемы эпидемиологии, диагностики и профилактики клещевого энцефалита. Иркутск, 1990, с. 75 76.

13. Леонова Г.Н. Кругляк С.П. Степанова И.М. Гореликов В.Н. Клинико-иммунологическое изучение эффективности вакцинации против клещевого энцефалита и Приморском крае. //Вопр. вирус. 1987, N 2. 225-228.

14. Лузин П.М. Киприянова Н.В. Шамарина А.Г. и др. Предварительные результаты применения концентрированной вакцины против клещевого энцефалита в Пермской области. //Актуал. пробл. вирусол. Тез. докл. Конф. Москва, 21-23 мая, 1985. М. 1985, с. 61-62.

15. Лапустин В.Н. Жанков А.И. Дживанян Т.И. Лашкевич Т.А. Характеристика низкомолекулярного невирионного (растворимого) антигена вируса клещевого энцефалита. //Вопр. вирусол. 1983, N 2, с. 200 206.

16. Ляпустин В.Н. Пиванова Г.П. Караванов А.С. Лашкевич В.А. Сопоставление протективных свойств препаратов вирионного и невирионного ("растворимого") антигенов вируса клещевого энцефалита. //Вопр. вирусол. М. 1991, N 6, с. 498 500.

17. Мельникова Е. Э. Антигены арбовирусов для серологических реакций. //Арбовирусы. М. 1986, с. 99-104.

18. Семенов Б.Ф. Некоторые статистические методы, используемые при обработке результатов вирусологических исследований. //В кн. Руководство по лабораторной диагностике вирусных и риккетсиозных болезней (под редакцией П. Ф. Здродовского и М.И. Соколова). М. 1965, с. 208 218.

19. Смородинцев Ал. А. Реакция нейтрализации. //В кн. Иммунологическая диагностика (под редакцией Т.В. Перадзе и П. Халонена). М. 1985, с. 21 48.

20. Соколова Е.Д. Камалов И.И. Кириленко В.А. и др. К вопросу об усовершенствовании инактивированной культуральной вакцины клещевого энцефалита посредством концентрирования вирусного антигена. //Труды Томского медицинского института. 1989, том 35, с. 32-39.

21. Хасаншин Р. Р. Осипова У.Г. Киселева Н.Н. Пустозерова Е.Ю. Очистка вакцины клещевого энцефалита методом микрофильтрации. //Современные проблемы эпидемиол. диагност. и профил. клещев. энцефал. Иркутск, 1990, с.85 86.

22. Хромых А.А. Беляев А.С. Руковишников М.Ю. и др. Экспрессия антигенов вируса клещевого энцефалита различными рекомбинантными вариантами вируса осповакцины. //Докл. АН СССР. 1990. Т. 310, N 4, с. 996-999.

23. Чумаков М.М. Рубин С.Г. Авдеева Л.И. и др. Способ получения вакцины против клещевого энцефалита. А. с. 1349757, СССР. Заявл. 20.02.85, N 3860449/28-13. //Бюл. изобр. 1987. N 41, кл A 61 K 39/12.

24. Эльберт Л.В. Красильников И.В. Дроздов С.Г. и др. Концентрированная и очищенная вакцина против клещевого энцефалита, изготовленная методом ультрафильтрации и хроматографии. //Вопр. вирусол. 1985, N 1, с. 90 93.

25. Elbert L.B. Terletskaya E.N. Timofeev A.V. el al. Inactivated vaccine against tick-borne encephalitis (TBE) derived from heteroploid continuous monkey cell line // Vaccine. 1989. V 7. N 5. P.477.

26. Barrett A. D. Gould E.A. Comparison of neurovirulence of different strains of yellow fever virus in mice. //J. Gen. Virol. 1986. 67. N 4. - P. 631 637.

27. Bhamarapravati Natth, Yoksan Sutee, Study of bivalent dengue vaccine in volunteers. //Lancet. 1989. N 8646. P. 1077.

28. Bhau L. N.Rao, Saxena S.N. Vaccines against Japanese encephalitis. //J. Commun. Discases. 1989. 21. N 1. P. 75 80.

29. Brandt W.E. Chiewsilp, Harris D.L. Russell P.K. Partial purification and characterization of a dengue virus soluble complement-fixing antigen. //J. Immunol. 1970. V. 105. P. 1565 1568.

30. Bock H. L. Klockmann U. Jungst C. et el. A new vaccine against tick-borne encephalitis: initial trial in man including a dose-response study. //Vaccine. 1990. V.8. N1. P. 22 24.

31. Бомфорд Р. Адьюванты. //В кн. Биотехнология клеток и животных. М, 1989, с. 264 280.

32. Cornesky R.A. Hammon W. Atcison R.W. Sather G.E. Effect of urea on the hemagglutinating and complement-fixing antigens of type-2 dengue virus. //Infect. Immunity. 1972. N 6. P. 952 957.

33. Falgout B. Bray M. Schlesinger J.J. Lai C.J. Immunization of mice with recombinant vaccinia virus expressing authentic dengue virus nonstructural protein NS1 protects against lethal dengue virus encephalitis. //J. Virol. 1990. V. 64. N 9. P. 4356 4363.

34. Frens G. Controlled nucleation for the regulation of the particle size in monodisperse gold suspension. //Nature Phys. Sci. 1973. V. 241. - P. 20 22.

35. Geoghegan W.D. Ackerman G.A. Adsorption of horseradish peroxidase, ovomucoid and immunoglobulin to colloidal gold for the indirect detection of concanavalin A. wheat germ agglutinatinin and goat antihuman immunoglobulin G an cell surfaces at the electron microscopic level: A new method, theory and application. //J. Histochem. Cytochem. 1977. V.25. N 11. P. 1187 - 1200.

36. Guirakhoo F. Heinz F.X. Dippe H. Kunz C. Antibody response to gp E of tick-borne ebcephalitis virus: comparison between natural infection and vaccination breakdown. //Zbl. Bakteriol. 1990. V.272. N4. P. 477 - 484.

37. Henchal E.A. Henchal L. Schlesinger J.J. Synergistic interactions of anti-NS1 monoclonal antibodies pritect passively immunized mice from lethal challenge with dengue 2 virus. //J. Gen. Virol. 1988. V.69 N 8. P. 2101 2107.

38. Хайнц Ф. Кунц К. Фаума Й. Шварц О. (Австрия). Способ получения вакцины таежного весенне-летнего энцефалитного вируса. А.с. 1003738, СССР. Заявл. 21.12.79, N 2854825/28-13. //Бюл. изобр. 1983. N 9, кл. A 61 K 39/12.

39. Horisberger M. Rosset J. Colloidal gold, a useful marker for transmission and scanning electron microscopy. //J. Histochem. Cytochem. - 1977. V.25. N 4. P. 295 305.

40. Kayser M. Klein H. Paasch I. et al. Human antibody response to immunization with 17D yellow fever and inactivated TBE vaccine. //J. Med. Virol. 1985. 17. N 1. P. 35-45.

41. Klockmann U. Bock H.L. Franke V. et al. Preclinical investigations of the safety, immunogenicity and efficacy of a purified, inactivated tick-borne encephalitis vaccine. //J. Biol. Stand. 1989. V.17. N. 4. - P. 331 342.

42. Lai C. J. Zhang Y, M, Bray M. et al. Immunization of monkeys with baculovirus recombinant-expressed dengue envelope and NS1 glycoproteins induces partial resistance to challenge with homotypic dengue virus. //In: Vaccines 90: modern approaches to new vaccines including prevention of AIDS.

Cold Spring Harbor, N.Y. 1990. P. 119-124.

43. Mason P. W. Pincus S. Fournier M.J. et al. Japanese encephalitis virus-vaccinia recombinants produce particulate forms of the structural membrane priteins and induce high levels of protection against lethal JEV infection. //Virology. 1991. V. 180. N 1. C.294 305.

44. Putnak J.R. Schlesinger J.J. Protection of mice against yellow fever virus encephalitis by immunization with a vaccinia virus recombinant encoding the yellow fever virus non-structural proteins, VS1, NS2a and NS2b. //J. Gen. Virol. 1990. V. 71. N 8. P. 1697 1702.

45. Roth J. The colloidal gold marker system for lith and electron microskopic cytochemistry. //Immunocytochem. 1983. N.2.

46. Schlesinger J. J. Brandriss M.W. Cropp C.B. Monath T.P. Protection against yellow fever in monkeys by immunization with yellow fever virus nonstructural protein NS1. //J. Virol. 1986. V. 60. N 3. P. 1153-1155.

47. Slot J.W. Geuse H.J. Sizing of protein A-colloidal golg probes for immunoelectron microscopy. //J. Cell. Biol. 1981. V.90. P. 533 536.

48. Smith C.E. Holt D. Chromatography of artropod-borne viruses on calcium phosphate columns. //Bull. W.H.O. 1961. V. 24. P. 749 759.

49. Smith T. G. Brandt W.E. Swanson J.L. Physical and biological properties of dengue-2 virus and associated antigen. //J. Gen. Virol. 1970. N 5. P. 524 532.

50. Tan C. H.C. Yap E.H. Singh M. et al. Passive protection studies in mice with monoclonal antibodies directed against the non-structural protein NS3 of dengue 1 virus. //J. Gen. Virol. 1990. V.71. P. 745 748.

51. Westaway E.G. Brinton M.A. Gaidamovich S. Ya. et al. Flaviviridae. //Intervirol. 1985. 24. P. 183 192.

52. Итоги науки и техники. Серия вирусология. Том 25. М. 1991. С. 30 82.

Использование: медицина, а именно медицинская вирусология. Сущность изобретения: растворимый агент вируса клещевого энцефалита, получаемый из сахарозо-ацетонового антигена после обработки его 8 - молярной мочевины, конъюгируют с гранулами коллоидного золота. Полученный конъюгат используют в качестве вакцины. 3 табл.

Способ получения вакцины против клещевого энцефалита на основе растворимого антигена, отличающийся тем, что растворимый антиген получают путем обработки восьмимолярной мочевиной сахарозо-ацетонового антигена этого вируса, после чего конъюгируют с гранулами коллоидного золота.