Способ определения гепарина в плазме крови Советский патент 1992 года по МПК G01N33/52 

Изобретение относится к медицине, а частности к лабораторным методам определения концентрации гепарина в плазме крови. ..-.. .: ,... ...... -... -. . / - : ,.

Цель изобретения - повышение точности способа и его ускорение.

Способ осуществляют следующим Обра- ЗОМ, ./ .. . ;. ..;.. - ;:. ;:. ,: - . ;.. -- . ;. .

Плазму крови разводят, добавляют водный раствор нестехиометрического интерполиэлектролитногокомплекса, содержащего полйметакрилат натрия; меченный флуоресцентной меткой,{ , и полй- М-этил-4-винилпирйдиний бромид при осномольном соотношении компонентов 10:1 - 2:1 и концентрации комплекса 10 - основомолей по метакрилату.

Добавление раствора производят алик- вотами до появления резкого изменения ин- тенсивности флуоресценции, т.е. до достижения точки излома (точки эквивалентности) на кривой зависимости интенсивности флуоресценции от количества добавленного полиэлектролитного комплекса.

Расчет концентрации гепарина проводят с использованием предварительно построенной калибровочной кривой зависимости интенсивности флуоресценции от концентрации гепарина.

П ри м е р 1. Плазму получают центрифугированием цельной крови, взятой в си- ликонированные пробирки, содержащие 3,8%-ный раствор цитрата натрия в объемном соотношении 9:1 (15 мин со скоростью 3000 об/мин). Полученную таким образом плазму разводят раствором трис-буфера в соотношении 1:4.

Подготовительным этапом является построение калибровочного графика, пригодного для работы весь период использования приготовленного раствора интерполиэлектролитного комплекса, который может храниться в течение длительного времени (не менее месяца) в условиях бытового холодильника (+4°С). Для работы использовался раствор 0,04 основомоль/л полиметакрила- та натрия (мол.масса 3500, одна пиреновая метка на 260 мономерных звеньев), раствор 0,01 основомоль/л поли-М-этил-4-винилпи- рмдиний бромида (мол.масса 290000 (соотношением компонентов комплекса 1:3) и 0,05 М трис-буфер с 0,05 М NaCI. Раствор нестехиометрическогр интерполиэлектро- литного комплекса готовят путем добавления к 0,5 мл раствора полиметакрилата натрия 0,67 мл раствора поливинилпири- диний бромида, затем добавляют 0,2 мл 0,1 М раствора гидроокиси натрия и 3,63 мл трис-буфера. Рабочий раствор готовят разведением исходного раствора интерполиэлектролитного комплекса до концентрации от до раствором 0,05 М NaCI в трис-буфере.

Измерение проводят на флуориметре IY3 CS, длина волны возбуждения 343 им, длина волны регистрации 395 нм.

Для построения калибровочного графика в кювету, помещенную в флуориметр, вносят 2,0 мл разведенной плазмы, добавляют 10 Мкл раствора интерполиэлектролитного комплекса и регистрируют значение интенсивности флуоресценции как начальную точку калибровочной кривой, Затем новую порцию плазмы, содержащую 0,005 ЕД гепарина, титровали рабочим раствором интерполиэлектролитного комплекса порциями по .1.0 мкл. Точка излома зависимости интенсивности флуоресценции от количества добавленного раствора полиэлектролитного.комплекса соответствует оттитрованному гепарину.

Аналогичная процедура проводится с образцами плазмы, содержащими 0,01; 0,015; 0,02; 0,025; 0,03 и т.д. до количества 1,0 ЕД гепарина.

Процедура исследования тестируемого образца плазмы протекает в пределах одной минуты и заключается в последователь- ном добавлении аликвот (10 мкл) нестехиометрического полиэлектролитного комплекса в рабочую кювету флуориметра. По точке излома кривой флуоресценции на калибровочной кривой определяется реальное значение количества гепарина в тестируемом образце плазмы.

Чувствительность метода 0,005 ЕД/мл. К 1 мл образца плазмы кролика добавляют 0,1 мл 0,001 %-ного раствора гепарина фирмы Рихтер (Венгрия) с активностью 130 ЕД/мг. В процессе титрования раствором интерполиэлектролитного комплекса в концентрации точка излома наступает

0 после внесения шестой порции титрующего агента (60 мкл), что составляет по калибровочному графику 0,0275 ЕД. Результат подтверждает, соответствие установленного количества гепарина внесенному в плазму

5 перед титрованием. Титрование продолжалось 20 с.

Пример 2. По методике, описанной в примере 1, определяют концентрацию гепарина в плазме крови массой 4 кг, в кра0 евую вену уха которого введен гепарин в дозе 50 ЕД/кг. Кровь берут через 5 мин после введения антикоагулянта. Используют раствор интерполимерного комплекса в рабочей концентрации . В результате

5 титрования плазмы интерполиэлектролит- ным комплексом в указанной концентрации определена точка излома, которая соответствует 0,175 ЕД гепарина. Титрование продолжается 45 с.

0 Пример 3. В плазме крови кролика, полученной в условиях, описанных в примере 2 и по методике, описанной в примере 1, определяют концентрацию гепарина с использованием рабочей концентрации ин5 терполиэлектролитного комплекса, равной , В результате титрования плазмы ин- терполиэлектролитным комплексом в указанной концентрации определена точка излома, которая соответствует 0,175 ЕД ге0 парина. Титрование продолжается 40 с.

Пример 4. Определение гепарина проводят, как в примере 1 при разных соотношениях компонентов полиэлектролитного комплекса и его концентрации

5 основомоль/л. Данные представлены в таблице.

Таким образом, преимуществами предложенного метода перед известным являются предел обнаружения гепарина в

0 плазме 0.005 ЕД (в 20 раз выше, чем по известному способу) и экспрессность метода-определение длится не более 60 с (по известному способу не более 4,5 мин) за счет определения концентрации гепарина

5 только в одном объеме плазмы крови при многократно повторяемой манипуляции последовательного добавления к ней постоян- ного объема водорастворимого нестехиометрического интерполиэлектролитного комплекса, содержащего флуоресцентную метку. В случае массовых обследований время трудозатрат снижается , чем в 4 раза.

Формула изобретен и я Способ определения гепарина в плазме крови, включающий титрование плазмы раствором нестехиометрического интерпо- лиэлектролитного комплекса на основе со- ли поликарбоновой ( . кислоты и полимерного основания, отличающий- с я тем, что, с целью повышения точности способа и его ускорения в качестве, интер

полиэлектролитного комплекса используют водный раствор полиметакрилата натрия, меченного флуоресцентной меткой, и поли- М-этил-4-винилпиридиния бромида при ос- новомолярном соотношении компонентов 10 - 2:1 и концентрации комплекса - основомоль/л по метакрилату, раствор комплекса добавляют в плазму до достижения точкой излома кривой зависимости интенсивности флуоресценции от .количества добавленного комплекса с последующим расчетом количества гепарина по калибровочной кривой.

Изобретение относится к медицине, в частности к лабораторном методам определения концентрации гепарина в плазме крови. Цель изобретения - повышение точности способа и его ускорение. Способ состоит в титровании плазмы крови водным раствором интерполиэлектролитного комплекса, состоящего из полиметилакрилата натрия, меченного флуоресцентной меткой, и поли-Г -этил-4--винилпиридиния бромида при осново-молярном соотношении компонентов 10:(1 -2): 1 и концентрации комплекса осново-молей/л по метакрилату. Раствор комплекса добавляют в плазму до достижения точки излома кривой зависимости интенсивности флуоресценции от количества добавленного комплекса с последуюа1им расчетом количества гепарина по калибровочной кривой. Изобретение позволяет повысить чувствительность способа в 20 раз и ускорить его не менее, чем в 4,5 раза, 1 табл.