Штамм вируса гриппа А(H10N1) для приготовления диагностических препаратов Советский патент 1992 года по МПК C12N7/00 

Изобретение относится к вирусологии, в частности к производству вирусологических диагностических препаратов.

Возможность экспериментального получения антигенных рекомбинантов, обладающих гемагглютинином одного вируса и нейраминидазой другого, продемонстрирована рядом исследователей, Большое количество подобных штаммов в последние годы изолировано от диких и домашних птиц и в естественных условиях в результате широко развернутого экологического изучения диких птиц в различных странах. Однако отсутствуют сведения о получении штамма- рекомбинанта вируса гриппа человека и птиц с сочетанием поверхностных антигенов H10JXII.

Цель изобретения - используя метод рекомбинации,- получить новый вариант штамма-рекомбинанта вируса гриппа H10N1, обладающего специфической имму- ногенной активностью, позволяющей ис- пользовать его. для приготовления диагностических препаратов при идентификации вновь выделяемых вирусов гриппа.

Штамм получен в опытах рекомбинации между вирусом гриппа человека A/PR/8/34 (H1N1) и вирусом гриппа птиц А/Трав- ник/Алма-Ата/760/79 (H10N5). Направленная селекция проводилась в системе куриных эмбрионов в присутствии гипериммунной сыворотки к рекомбинантному штамму H1N5. После 5 последовательных пассажей в присутствии сыворотки выделен рекомбинант, обозначенный R-1 с антигенной формулой H10N1. Полученный рекомбинант трижды клонирован методом предельных разведений и был генетически стабилен. Антигенная характеристика и результаты изучения генетических признаков у родительских вирусов и рекомбинантов представлены в табл. 1 и 2.

Из таблицы следует, что рекомбинант обладал гемагглютинином птичьего вируса - НЮ и нейраминидазой N1 человеческого штамма.

Представленный штамм депонирован под номером ГКВ № 2235 и имеет следующие молекулярно-биологические свойства.

Адаптационные свойства. Полученный рекомбинант активно репродуцируется в системе куриного эмбриона при оптималь- ной (36°С), повышенной (40°С) температурах до инфекционного титра 8,25-8,75 Ig ЭИДзо/0,2 мл и менее активно при пониженной (28°С) температуре инкубации. Рекомбинант обладает высокой гемагглю- тинирующей(титр 1/512-1/1024) и иммуно- генной активностью.

Полученный рекомбинант репродуцируется в клетках МДСК до 4,0 Ig ТЦД50, в клетках Vero - 4647 до 3,01д ТЦДзо, в клет- ках ВНК-21 до 2,01д ТЦДбО и в первичных клетках ФЭЧ до 2,01д ТЦЦбО.

У рекомбинанта R-1 степень репродукции в органных культурах почек эмбриона человека на 1-21д была выше способности

к репродукции обоих родителей (A/PR/8/34, А/Травник/Алма-Ата/760/79).

Терморезистентность (Tse - признак). Селекционированный рекомбинант обладает так же, как и один из родительских штаммов A/PR/8/34 (H1N1), терморезистентным гемагглютинином (Tse - 2 ч). Однако гемагг- лютинин вируса-рекомбинанта был более устойчив к прогреванию, чем гемагглюти- нин другого родительского штамма А/трав- ник/Алма-Ата/760/79.

Патогенные свойства. Исследуемый штамм-рекомбинант проявляет слабо выраженную патогенность (2,01g LDso) для белых мышей по сравнению со штаммом A/PR/8/34(H1N1), вызывающим гибельжи- вотных в дозе 4,01g LDso.

Моле кул ярно-биологический анализ. Анализ генов предлагаемого штамма показал, что рекомбинант R-1 приобрел от родительского штамма A/PR/8/34 4 гена (NP, NA, М и NS), остальные4 гена (РВ1, РВ2, РА, НА) - от другого родителя А/травник/Алма- Ата/760/79.

Пример. Диагностическую иммунную сыворотку получают на кроликах породы шиншилла или на белых крысах. В качестве антигена для иммунизации используют элюат вируса из формалинизированных эритроцитов кур. Титр гемагглютининов составляют 1/1024..

Схема иммунизации. Кролику непосредственно в оба подколенных лимфатических узла вводят 0,1 мл антигена с адьювантом. Через месяц повторно инъецируют антиген в том же количестве, но без адьюванта. Антиген разводят в большом количестве физиологического раствора и вводят кроликям внутривенно (0,2 мл), внутримышеч о (передняя лапа; 0,4 мл) и в область одного из подколенных лимфатических узлов (0,4 мл). Кровь у кроликов берут из краевой вены уха через 10-14 дней после иммунизации.

Специфичность и активность антисывороток определяют в РТГА, Полученные сыворотки имеют титр антигемагглютини- рующих антител 1:5120 и выше.

Иммунную сыворотку освобождают от неспецифических ингибиторов обработкой отечественным препаратом нейраминида- зы из нехолерного вибриона (RDE).

Предлагаемый штамм-рекомбинант вируса гриппа A(H10N1)-R-1 и изготовленный на его основе диагностический препарат может найти применение в вирусологической практике для идентификации вновь

выделенных штаммов и изучения иммунологической структуры населения, домашних и диких животных.

Ф о р м у л а и з о б р ет е н и я Штамм вируса гриппа А(Н10М1), ГКВ

2235, для приготовления диагностических

препаратов.

Изобретение относится к вирусологии, в частности к производству вирусологических диагностических препаратов. Цель изобретения - используя метод рекомбинации, получить новый вариант штамма-ре- комбинанта вируса гриппа H10N1, обладающего специфической иммуноген- ной активностью, позволяющей использовать его для приготовления диагностических препаратов при идентификации вновь выделяемых вирусов гриппа. Штамм (Ш) вируса гриппа A(C10N1) представляет собой селекционированный ре- комбинант вирусов гриппа человека и птиц с новой антигенной формулой. LL агглютинирует эритроциты кур в титрах 1:640, активно репродуцируется при оптимальной

Таблица 1 Изучение антигенного состава родительских штаммов и рекомбинанта

Таблица2

Антигенные и биологические свойства родительских штаммов и рекомбинантов

А/РК/В/З

H1N1

М 5,0

8,0

5,0