Способ деконтаминации микобактериальных культур Советский патент 1992 года по МПК C12N1/20 

Изобретение относится к лабораторным исследованиям и может быть использовано для получения чистых культур сапрофитных и условно патогенных микобактерий из контаминированных первичных культур.

Известен способ деконтаминации ми- кобактериальных культур по Дригальскому путем дробного посева в чашки Петри.

Недостатком этого способа является низкая эффективность, обусловленная тем, что микобактерий растут группами, которые из-за наличия склеивающего воскообразного вещества трудно разделить на отдельные клетки для получения гомогенной взвеси, в результате чего в конгломератах сохраняется посторонняя микрофлора, Кроме того, отдельная клетка микобактерий не образует колоний; для этого необходима группа клеток при посеве не менее 20-100 в 1 мл жидкости.

Цель изобретения - повышение чистоты культуры.

Поставленная цель достигается тем. что микобактериальные культуры обрабатывают бактериостатиком, в качестве которого используют Дезоксон-4 в концентрации 0,1-2,0 об.%, а обработку проводят в течение 5-60 мин.

Способ осуществляется следующим образом.

На картофельно-глицериновую среду Павловского засевают контаминированную культуру микобактерий и выращивают в течение 5-15 дней. Готовят 2-миллиардную взвесь и пропитывают ею батистовые тест- объекты. Через 10 мин тест-объекты извлекают и подсушивают в стерильной чашке

VT

N5

Јь

О 00

ел

Петри на фильтровальной бумаге в течение 10 мин, после чего переносят в другую стерильную чашку Петри на фильтровальную бумагу. Чашки с приоткрытой крышкой помещают в термостат для фиксации культур на 20 мин при 37°С.

Тест-объекты с зафиксированной на них культурой помещают по 12 штук в 3 пробирки с раствором Дезоксона-4 в концентрациях с 0,1% из расчета 2 мл на один тест-объект. Через 5 мин из каждой пробир- ки извлекают по одному тест-объекту, кото- рый помещают в пробирку с 5 мл стерильной дистиллированной воды на 5 мин с последующим переносом в другую пробирку со стерильной дистиллированной водой на 5 мин, а затем - в пробирку с 10 мл среды Линниковой - Могилевского.

При выборе исходной концентрации препарата учитывают чувствительность к нему основных контаминантов микобакте- риальных культур. Воздействуя на микроорганизмы, Дезоксон-4 убивает: Escherichia coll в концентрации 0,001 % при экспозиции 15 мин; Staphilococcus aureus в концентрации 0,02% при экспозиции 20 мин; Bacillus athrocaides в концентрации 0,03% при экс- позиции 15 мин.

Пример1.На картофельно-глицери- новую среду Павловского засевают конта- минированную культуру микобактерий и выращивают в течение 5-15 дней. Наличие микобактерий в культуре проверяют микроскопией с окраской мазков по Цилю-Ниль- сену.

Из выросшей микобактериальной куль- туры готовят 2-миллиардную взвесь в физи- ологическом растворе и погружают в нее тест-объекты из расчета 10 мл бактериальной взвеси на 50 штук тест-объектов.

Тест-объекты готовят следующим обра- зом.

Кусок батиста погружают на 24 ч в холодную воду для удаления аппературы, тщательно стирают с мылом, кипятят, сушат и гладят горячим утюгом. В приготовленном таким образом куске ткани с помощью иглы выдергивают нитки в продольном направлении на расстоянии 11 мм, в поперечном - 6 мм. По этим линиям батист разрезают на тест-объекты, которые по 50 штук расклады- вают в чашки Петри; последние заворачивают в бумагу, стерилизуют в автоклаве в течение 30 мин при 110°С (0,5 атм).

После погружения через 20 мин в асептических условиях батистовые тест-объек- ты, пропитанные культурой, переносят на стерильную фильтровальную бумагу (2 слоя на дне чашки Петри), покрывают сверху фильтровальной бумагой, закрывают чашки

Петри крышкой. Для фиксации после удаления избытка жидкости тест-объекты переносят на стерильную фильтровальную бумагу в чашки Петри, покрывают стерильной фильтровальной бумагой и помещают в термостат на 20 мин при 37°С с приоткрытой крышкой.

В пробирке готовят раствор Дезоксона- 4 на стерильной дистиллированной воде из расчета 2 мл на один тест-объект в концентрациях с 0,1%. В пробирки погружают по 12 тест-объектов. Через каждые 5 мин из пробирок с раствором Дезоксона-4 извлекают по одному тест-объекту и помещают каждый в отдельности в пробирки с 5 мл стерильной дистиллированной воды, через 5 мин их переносят в другие прибирки с 5 мл стерильной дистиллированной воды для отмывки Дезоксона-4 на 5 мин с последующим погружением в пробирки с 10 мл среды Линнико- вой-Могилевского. Пробирки помещают в термостат для культивирования при 37°С.

Учет роста проводят через 5-7 дней. Чистоту роста определяют микроскопией мазка с культуры, окрашенной по Цилю-Нильсену.

Микобактериальная культура считается чистой, если в 20 полях зрения нет посторонней микрофлоры.

П р и м е р 2. Подготовку культур, декон- таминацию и учет результатов проводят как в примере 1. В трех пробирках готовят растворы Дезоксона-4 в концентрациях 0,1; 1,0 и 2,0% соответственно. Результаты представлены в табл..1.

Из табл. 1 видно, что рост микобактерий прекращается при концентрации Дезоксона-4 1,0% и экспозиции 3.0 мин. Микобакте- риальные культуры, обработанные Дезоксоном-4 в концентрации 1,0% при экспозиции 20 и 25 мин, дают чистый рост.

П р и м е р 3. Подготовку культур, декон- таминацию. учет результатов проводят как в примере 1. Испытывают следующие концентрации Дезоксона-4 0,5; 1,0 и 2,0%. Результаты представлены в табл. 2.

Как видно из табл. 2 при концентрации Дезоксона-4 2,0% даже при экспозиции 5 мин рост микобактерий отсутствует. Необходимо повторить обработку Дезоксоном-4, выбрав концентрацию Дезоксона-4 в пределах 1.0-2,0%.

Приме р 4. Подготовку культур, декон- таминацию, учет результатов проводят, как в примере 1. Испытывают концентрации Дезоксона-4 0,5; 1,0 и 1,5%. Результаты представлены в табл. 3.

Параметры способа обеспечивают уничтожение посторонней микрофлоры, однако микобактерии, обладающие устойчивостью к широкому спектру химических веществ, включая чистоты, выживают при концентрации препарата, убивающей другие относительно устойчивые микроорганизмы. Выбор концентрации Дезоксона-4 зависит от характеристик микобактерий. Обработке подвергают контаминированный материал без предварительной идентификации микобактерий, поэтому подбор концентрации Дезоксона-4 начинают с концентрации 0,1%, необходимой и доста

точной для уничтожения основных комнта- минантов.

Формул а изо б р е т е н и я Способ деконтаминации микобактери- альных культур путем обработки бактери- остатиком, отличающийся тем, что, с целью повышения чистоты культуры, в качестве бактериостатика используют Дезок- сон-4 в концентрации 0,1-2,0 об.%, а обработку проводят в течение 5-60 мин.

Использование: микробиология, выделение чистых культур сапрофитных и условно патогенных микобактерий из контаминированных первичных культур. Сущность изобретения: готовят двухмиллиардную взвесь контаминированной мико- бактериальной культуры. Пропитывают ею батистовые тест-объекты и подсушивают. Тест-объекты помещают в пробирки с раствором Дезоксона-4 в концентрациях 0,1- 2%. После обработки Дезоксоном тест-объекты извлекают из пробирок, промывают дистиллированной водой и помещают в пробирки с 10 мл среды Линниковой. Пробирки со средой культивируют при 37°С в течение 5-7 дней, полученные культуры окрашивают по Цилю-Нильсенуи микроско- пируют. Макобактериальная культура считается чистой, если в 20 полях зрения нет посторонней микрофлоры. 3 табл.

Примечание. наличие роста;

Примечание. наличие роста; - -отсутствие роста.

Таблица 1

- -отсутствие роста.

Таблица 2

Таблица 3