НАКОПИТЕЛЬНАЯ ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ТРАНСПОРТИРОВКИ БИОМАТЕРИАЛА И ОБЪЕКТОВ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ, КОНТАМИНИРОВАННЫХ ПОСТОРОННЕЙ МИКРОФЛОРОЙ, ПОДЛЕЖАЩИХ ИССЛЕДОВАНИЮ НА БРУЦЕЛЛЕЗ Российский патент 2021 года по МПК C12N1/20 C12Q1/04 

Изобретение относится к медицинской, санитарной и ветеринарной микробиологии и может быть использовано для транспортировки биоматериала, зараженного или подозрительного на зараженность возбудителем бруцеллеза, и объектов окружающей среды, контаминированных посторонней микрофлорой, подлежащих исследованию на бруцеллез, и накопления культуры бруцелл.

Известна питательная среда жидкая для транспортировки биоматериала и накопления бруцелл следующего состава: гидролизат Хоттингера (из расчета содержания в 1 л среды сухих веществ)-23-25 г, натрий хлористый -5,0 г/л, глицерин-20,0 г/л, глюкоза-10,0 г/л, натрий лимоннокислый-5,0 г/л, липоевая кислота-0,5 г/л, дистиллированная вода-до 1 л, ТУ 9385-025-01897080-2011 «Питательная среда жидкая для транспортировки биоматериала и накопления бруцелл». Недостатком данной питательной среды является то, что она предназначена для транспортировки только стерильного, не контаминированного посторонней микрофлорой биоматериала (кровь, спинномозговая жидкость, костный мозг, желчь), полученного от пациентов, подозреваемых на заболевание бруцеллезом. Даже незначительного обсеменения посторонней бактериальной или грибковой микрофлорой достаточно для полного вытеснения и гибели бруцелл через несколько суток.

Для транспортировки бруцелл может быть использована транспортная среда Amies следующего состава, (г/л): уголь активированный-10,0; натрия хлорид-3,0; натрий фосфорнокислый двузамещенный-1,15; калий фосфорнокислый - 0,2; калия хлорид-0,2; натрия тиогликолят-1,0; кальция хлорид-0,1; магния хлорид-0,1; агар микробиологический-4,0; рН 7,4±0,2 [1]. Ввиду отсутствия питательных веществ роста посторонней микрофлоры не происходит, однако и количество жизнеспособных микробных клеток возбудителя бруцеллеза на данной среде в присутствии контаминантов при хранении (транспортировке) резко снижается-через 7 суток количество вырастающих колоний уменьшается в 30-100 раз. Поэтому данная среда рекомендуется для транспортировки только чистых культур бруцелл.

Ввиду того, что основным препятствием для выделения бруцелл после транспортирования биоматериала или объектов окружающей среды, контаминированных посторонней микрофлорой, в соответствующей питательной среде является жизнедеятельность загрязняющих микроорганизмов, а именно, потребление питательных веществ и продуцирование бактериоцинов, необходимо подавить рост и размножение посторонней микрофлоры путем введения в состав транспортной среды ингредиентов, обладающих избирательным селективным действием.

Наиболее близким предполагаемому изобретению является сывороточно-декстрозный бульон с селективной добавкой Farrell [2]. Основа сывороточно-декстрозного бульона состоит из (г/л): гидролизата казеина-10,0; пептического перевара животной ткани-10,0; дрожжевого экстракта-2,0; глюкозы-10,0; хлорида натрия-5,0; натрия бисульфита-0,1; рН 7,0±0,2 Инактивированная при температуре 56°С в течение 30 мин лошадиная сыворотка добавляется в простерилизованную и охлажденную до температуры 50-55°С основу сывороточно-декстрозного бульона в количестве 5% от объема основы среды. В состав селективной добавки для приготовления 1 л среды входят: полимиксин В-5000 ME; бацитрацин-25000 ME; циклогексимид-0,1 г; налидиксовая кислота-0,005 г; нистатин-100000 ME; ванкомицин-0,02 г. Среда рекомендована для обогащения, выделения и культивирования бруцелл из клинического и другого материала, однако она может применяться и для транспортировки указанного материала в бактериологическую лабораторию. Вместе с тем, данный препарат недостаточно ингибирует Pseudomonas, Proteus, Alkaligenes faecalis, Bacillus cereus и Citrobacter freundii, а содержащиеся в этой среде бацитрацин и налидиксовая кислота в регламентированных концентрациях сильно угнетают рост В. ovis и В. suis, а также некоторых штаммов В. melitensis и В. abortus [3, 4].

Целью предполагаемого изобретения является получение накопительной питательной среды с усиленными ингибирующими свойствами в отношении сопутствующей микрофлоры, особенно псевдомонад, при этом обеспечивающей повышение жизнеспособности бруцелл.

Сущность изобретения заключается в оптимальном подборе компонентов питательной среды, сочетающих усиленную ингибирующую активность в отношении посторонней грамположительной, грамотрицательной бактериальной флоры и микофлоры, а также питательную ценность для возбудителя бруцеллеза и ростостимулирующие факторы, способствующие повышению его жизнеспособности.

Поставленная цель достигается тем, что в качестве основного источника азотистого питания в предлагаемой среде используется ферментативный гидролизат казеина, в качестве стимуляторов роста-дрожжевой экстракт, глюкоза и глицерин, для поддержания изотоничности среды и окислительно-восстановительного потенциала-натрий хлористый и натрий сернистокислый пиро, для предотвращения свертывания крови-натрий лимоннокислый, селективными агентами служат малахитовый зеленый, ванкомицин, амфотерицин В, цефтазидим при следующем соотношении ингредиентов, г/л:

Гидролизат казеина

(из расчета содержания в 1 л среды сухих веществ) 7,0-9,0; Дрожжевой экстракт 0,5-1,5 Натрий хлористый 4,0-6,0 Глюкоза 0,5-2,0 Глицерин 4,0-6,0 Натрий лимоннокислый 3-зам. 5,5-водный 4,0-6,0 Натрий сернистокислый пиро 0,05-0,3 Малахитовый зеленый 0,00045-0,00055 Ванкомицин 0,015-0,025 Цефтазидим 0,001-0,002 Амфотерицин В 0,005-0,02 Вода дистиллированная до 1 л

Среду готовят следующим образом. В емкость эмалированную или из нержавеющей стали, вместимостью 1,5-2,5 л, наливают ферментативный гидролизат казеина, из расчета содержания в 1 л среды 8 г сухих веществ, затем вносят следующие ингредиенты: дрожжевой экстракт - 1,0 г, натрий хлористый - 5,0 г, глюкозу - 1,0 г, глицерин - 5,0 г, натрий лимоннокислый 3-зам. 5,5-водный - 5,0 г, натрий сернистокислый пиро - 0,2 г, малахитовый зеленый - 0,0005 г, ванкомицин - 0,02 г. Навески ингредиентов тщательно размешивают, объем смеси доводят дистиллированной водой до 1 л, устанавливают рН в пределах 7,0-7,4 с помощью 18% раствора соляной кислоты или 20% раствора натрия гидроокиси.

Емкость с питательной средой помещают на газовую плиту, нагревают содержимое до кипения, кипятят в течение 2-3 мин, разливают в бутылки стеклянные по 330 мл, закрывают ватно-марлевыми пробками и накрывают "колпачком" из бумаги Крафт. Укупоренные бутылки со средой стерилизуют автоклавированием в течение 20 мин при температуре (121±1)°С, затем охлаждают до комнатной температуры. В среду добавляют цефтазидим и амфотерицин В, - из расчета содержания 0,0015 мг/л и 0,01 мг/л, соответственно, и перемешивают. Далее, питательную среду асептически разливают по 9,0 мл в стерильные пробирки, которые закрывают ватно-марлевыми пробками. После окончания розлива проводят замену ватно-марлевых пробок на стерильные резиновые №14,5.

Пример 1. В емкость эмалированную или из нержавеющей стали, вместимостью 1,5-2,5 л, наливают ферментативный гидролизат казеина, из расчета содержания в 1 л среды 7 г сухих веществ, затем вносят следующие ингредиенты: дрожжевой экстракт - 0,5 г, натрий хлористый - 4,0 г, глюкозу - 0,5 г, глицерин - 4,0 г, натрий лимоннокислый 3-зам. 5,5-водный - 4,0 г, натрий сернистокислый пиро - 0,05 г, малахитовый зеленый - 0,00045 г, ванкомицин - 0,015 г. Навески ингредиентов тщательно размешивают, объем смеси доводят дистиллированной водой до 1 л, устанавливают рН в пределах 7,0-7,4 с помощью 18% раствора соляной кислоты или 20% раствора натрия гидроокиси.

Емкость с питательной средой помещают на газовую плиту, нагревают содержимое до кипения, кипятят в течение 2-3 мин, разливают в бутылки стеклянные по 330 мл, закрывают ватно-марлевыми пробками и накрывают "колпачком" из бумаги Крафт. Укупоренные бутылки со средой стерилизуют автоклавированием в течение 20 мин при температуре (121±1)°С, затем охлаждают до комнатной температуры. В среду добавляют цефтазидим и амфотерицин В из расчета содержания 1,0 мг/л и 5 мг/л, соответственно, и перемешивают. Далее, питательную среду асептически разливают по 9,0 мл в стерильные пробирки, которые закрывают ватно-марлевыми пробками. После окончания розлива проводят замену ватно-марлевых пробок на стерильные резиновые №14,5.

Данный состав соответствует минимальной концентрации ингредиентов.

Пример 2. Отличается от примера 1 тем, что в среду вносят, из расчета содержания в 1 л среды сухих веществ, ферментативный гидролизат казеина - 8 г, дрожжевой экстракт - 1,0 г, натрий хлористый - 5,0 г, глюкозу - 1,0 г, глицерин - 5,0 г, натрий лимоннокислый 3-зам. 5,5-водный - 5,0 г, натрий сернистокислый пиро - 0,2 г, малахитовый зеленый - 0,0005 г, ванкомицин - 0,02 г, цефтазидим - 0,0015 г, амфотерицин В - 0,01 г, что соответствует оптимальной концентрации ингредиентов.

Пример 3. Отличается от примеров 1 и 2 тем, что в среду вносят, из расчета содержания в 1 л среды сухих веществ, ферментативный гидролизат казеина - 9 г, дрожжевой экстракт - 1,5 г, натрий хлористый - 6,0 г, глюкозу - 2,0 г, глицерин - 6,0 г, натрий лимоннокислый 3-зам. 5,5-водный - 6,0 г, натрий сернистокислый пиро - 0,3 г, малахитовый зеленый - 0,00055 г, ванкомицин - 0,025 г, цефтазидим - 0,002 г, амфотерицин В - 0,02 г.

Данный состав соответствует максимальной концентрации ингредиентов.

Биологические свойства предлагаемой среды (примеры 1-3), и среды-прототипа (сывороточно-декстрозного бульона с селективной добавкой Farrell) определяли с помощью посева в среды бактериальной смеси тест-штамма Brucella abortus 19 В А и тест-штаммов микроорганизмов разных таксономических групп {Staphylococcus aureus АТСС 25923, Enterococcus faecium VKM B-602, Proteus vulgaris HX-19 222, Pseudomonas aeruginosa 22/99) следующим образом.

Тест-штамм В. abortus 19 ВА со среды хранения пересевали в 2 пробирки с бульоном Альбими и чашку Петри с агаром Альбими или на эритрит-агар. Тест-штаммы S. aureus АТСС 25923 и Е. faecium VKM B-602, P. vulgaris HX-19 222, P. aeruginosa 22/99 со среды хранения - в 2 пробирки с питательным бульоном или бульоном Хоттингера (рН 7,2) и чашки Петри с питательным агаром или агаром Хоттингера (рН 7,2). Посевы бруцелл инкубировали при температуре (37±1)°С в течение (48±2) ч, посевы других микроорганизмов - при той же температуре в течение (24±2) ч.

Выросшую культуру каждого тест-штамма проверяли на чистоту роста, отсутствие диссоциации, затем В. abortus 19 В А пересевали в пробирку со скошенным агаром Альбими или эритрит-агаром, культуры других микроорганизмов - в пробирки со скошенным питательным агаром или агаром Хоттингера (рН 7,2). После инкубации посевов бруцелл при температуре (37±1)°С в течение (48±2) ч, ассоциантов-в течение (24±2) ч, культуры использовали для сравнительного контроля питательных сред. С использованием стерильного 0,9% раствора натрия хлорида готовили стандартные взвеси культуры каждого тест-штамма, соответствующие 10 ME по ОСО 42-28-85. Полученную микробную взвесь культуры В. abortus 19 ВА разводили сначала до концентрации 1×10⁹ м.к./мл и затем, десятикратными разведениями, - до 1×10³ м.к./мл (разведение 10^-6). Микробные взвеси S. aureus АТСС 25923 и Е. faecium VKM B-602, P. vulgaris HX-19 222, P. aeruginosa 22/99 десятикратными разведениями доводили до разведения 10^-4. В процессе разведения перенос взвеси в следующую пробирку производили стерильной пипеткой объемом 1 мл, меняя пипетку для каждого разведения.

По 3,0 мл микробной взвеси тест-штамма В. abortus 19 В А из разведения 10^-6, микробных взвесей тест-штаммов S. aureus АТСС 25923, Е. faecium VKM B-602, P. vulgaris HX-19222, P. aeruginosa 22/99 из разведения 10^-4 вносили в пустую стерильную пробирку, перемешивали.

По 0,1 мл смеси высевали на 3 чашки Петри с питательной средой для культивирования бруцелл или эритрит-агаром и равномерно распределяли покачиванием по всей поверхности среды («нулевой посев»). Одновременно по 1,0 мл смеси культур вносили в 3 пробирки с 9,0 мл каждой питательной среды и инкубировали при температуре (37±1)°С в течение 14 сут. Через 2 сут, 7 сут и 14 сут инкубации при температуре (37±1)°С по 0,1 мл микробной взвеси из каждой пробирки с предлагаемой средой по рецептурам, приведенным в примерах 1-3, и средой-прототипом высевали на 3 чашки Петри с эритрит-агаром. Засеянные чашки с подращиванием и без подращивания инкубировали при температуре (37±1)°С в течение (72±2) ч.

На чашках с «нулевым посевом» через 24-48 ч инкубации при (37±1)°С наблюдался рост большого количества (>1000) колоний ассоциантов или их сливной рост, «роение» протея, распространяющееся на 80-100% поверхности среды, на некоторых чашках образование синегнойной палочкой пигмента пиоцианина. Колоний В. abortus 19 ВА не было обнаружено в течение всего срока наблюдения.

Сравнительная характеристика результатов посева микробных взвесей из предлагаемой среды и среды-прототипа представлены в таблице 1.

Из данных таблицы видно, что из исследованных микроорганизмов на сравниваемых средах вырастают только бруцеллы и псевдомонады, рост стафилококков, энтерококков и протея полностью подавлен. Предлагаемая среда имеет преимущество перед средой-прототипом, т.к. при посеве из нее уже через 48 ч (2 сут) культивирования количество вырастающих колоний бруцелл больше, чем на порядок, превышает аналогичный показатель сывороточно-декстрозного бульона с селективной добавкой Farrell. Из последней среды через 7 и 14 суток высеять В. abortus 19 ВА не удавалось, в те же сроки из предлагаемой среды бруцеллы выделялись, а в примере 2 на фоне нарастания количества бруцелл происходило вытеснение псевдомонад.

Изменение количественного соотношения компонентов предлагаемой среды вело к нарушению биологических показателей качества препарата.

Так, в случае приготовления среды в соответствии с примером 1, недостаточно ингибировался рост псевдомонад, которые, в свою очередь, подавляли рост бруцелл. На среде, приготовленной в соответствии с примером 3, наряду с незначительным усилением ингибиции псевдомонад, в большей степени подавлялся рост В. abortus 19 ВА.

Пример 2 является оптимальным по количеству подобранных ингредиентов накопительной питательной среды для транспортировки биоматериала и объектов окружающей среды, контаминированных посторонней микрофлорой, подлежащих исследованию на бруцеллез, которое позволяет при достаточном ингибировании посторонней микрофлоры достичь повышения жизнеспособности возбудителя бруцеллеза и максимального выделения бруцелл.

Жизнеспособность бруцелл в предлагаемой среде (пример 2) и среде-прототипе определяли с помощью посева в среды чистых культур тест-штаммов В. abortus 19 ВА и В. melitensis Rev I следующим образом.

Подготовку тест-штаммов проводили аналогично описанной для тест-штамма В. abortus 19 ВА. Полученные микробные взвеси культур разводили сначала до концентрации 1×10⁹ м.к./мл, а затем, десятикратными разведениями, - до 1×10³ м.к./мл. По 1,0 мл микробной взвеси каждого тест-штамма из разведения 10^-6 вносили в 3 пробирки с 9,0 мл каждой из сравниваемых сред: предлагаемой среды и сывороточно-декстрозного бульона с селективной добавкой Farrell, перемешивали и инкубировали при температуре (37±1)°С в течение 21 сут.

При посеве, а также через 72 ч (3 сут), 168 ч (7 сут), 336 ч (14 сут), 504 ч (21 сут) инкубации при температуре (37±1)°С по 0,1 мл микробной взвеси из каждой пробирки высевали на 3 чашки Петри с эритрит-агаром.

Засеянные чашки с эритрит-агаром инкубировали при температуре (37±1)°С в течение 70-74 ч (3 сут).

Данные о жизнеспособности бруцелл после пересева из накопительной питательной среды для транспортировки биоматериала и объектов окружающей среды, контаминированных посторонней микрофлорой, подлежащих исследованию на бруцеллез (приготовленной в соответствии с примером 2) и среде-прототипе, представлены в таблице 2.

Из данных таблицы видно, что предлагаемая питательная среда имеет преимущество, так как на ней бруцеллы сохраняют жизнеспособность в течение 21 сут (срок наблюдения), в то время как из среды-прототипа высев бруцелл становится проблематичным уже на 1-2 неделе культивирования, а к 3 неделе практически невозможен.

Предлагаемая питательная среда разработана на основе доступных отечественных ингредиентов, проста в применении.

Улучшенные биологические свойства предлагаемой среды, наряду с доступностью входящих в нее ингредиентов, повышают эффективность работ, связанных с культивированием бруцелл.

Список цитированных документов

1. Amies С.R. A modified formula for the preparation of Stuart's transport medium 11 Canadian Journal of Public Health/Revue Canadienne de Sante'e Publique. 1967; 296-300.

2. Основа агара / бульона для бруцелл / HiMedia Laboratories Pvt. Limited (Индия) / [Электронный ресурс]. URL: http://www. himedialabs.ru/m074-m348 (дата обращения 22.08.2019).

3. Marin С.М., М.Р., Blasco J.M. Comparison of two selective media for the isolation of Brucella melitensis from naturally infected sheep and goats. Vet Rec. 1996; 138 (17):409-11. DOI: 10.1136/vr. 138.17.409.

4. De Miguel M.J., Marin С.М., Munoz P.M., Dieste L., Grillo M.J., Blasco J.M. Development of a selective culture medium for primary isolation of the main Brucella species. J Clin Microbiol. 2011; 49(4): 1458-1463. DOI:10.1128/JCM.02301-10.

Изобретение относится к медицинской, санитарной и ветеринарной микробиологии и может быть использовано для транспортировки биоматериала, зараженного или подозрительного на зараженность возбудителем бруцеллеза, и объектов окружающей среды, контаминированных посторонней микрофлорой, подлежащих исследованию на бруцеллез, и накопления культуры бруцелл. Накопительная питательная среда содержит гидролизат казеина, дрожжевой экстракт, натрий хлористый, глюкозу, глицерин, натрий лимоннокислый 3-зам. 5,5-водный, натрий сернистокислый пиро, малахитовый зеленый, ванкомицин, цефтазидим, амфотерицин В и дистиллированную воду при заданном соотношении компонентов. Изобретение позволяет сохранять жизнеспособность бруцелл в течение 21 суток. 2 табл., 3 пр.

Накопительная питательная среда для транспортировки биоматериала и объектов окружающей среды, контаминированных посторонней микрофлорой, подлежащих исследованию на бруцеллез, со следующим соотношением ингредиентов, г/л:

Гидролизат казеина

(из расчета содержания в 1 л среды сухих веществ) 7,0-9,0 Дрожжевой экстракт 0,5-1,5 Натрий хлористый 4,0-6,0 Глюкоза 0,5-2,0 Глицерин 4,0-6,0 Натрий лимоннокислый 3-зам. 5,5-водный 4,0-6,0 Натрий сернистокислый пиро 0,05-0,3 Малахитовый зеленый 0,00045-0,00055 Ванкомицин 0,015-0,025 Цефтазидим 0,001-0,002 Амфотерицин В 0,005-0,02 Вода дистиллированная до 1 л