Способ определения патогенности искусственных комбикормов для карповых рыб Советский патент 1992 года по МПК A01K61/00 A23K1/00 

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано в комбикормовой промышленности и рыбоводстве для определения патегенности искусственных комбикормов..

Известны гостированные способы контроля санитарного состояния комбикормов (1,2 и 3), которые однако не предусматриват ют контроль за количеством грибной микрофлоры в корме, а также имеют низкую степень достоверности, так как основаны на органолептическйх показателях.

Наиболее близким к предлагаемому является способ контроля и оценки качества кормов для рыб. Указанный способ предусматривает определение видового состава грибной микрофлоры корма, в т.ч. грибов рода Candida и сравнение полученных данных с предельно допустимой нормой их содержания в 1 г корма, которая составляет 500 клеток..

Как показали исследования, одной из доминирующих культур микрофлоры в комбикормах для карповых рыб являются грибы.

. Указанные грибы яйляются условно-патогенной микрофлорой и содержатся в определенном количестве во всех комбикормах, проявляя свою патогенность либо изначально, либо при увеличении их содержания в корме сверх допустимого количества, что в свою очередь связано с нарушением технологии производства кормов и условий их хранения. В связи с этим объективно необходимо контроль за санитарным состоянием кормов.

«ч ю ю со

Однако контроль санитарного состояния искусственных комбикормов для карповых рыб путем учета только количественного содержания данного рода грибов в корме явно недостаточен.

Так, установлено, что внутри только одного вида Candida guillermonclll, входящих в род грибов Candida, имеются как патогенные, так и непатогенные грибы. При ежедневном пероральном введении рыбам в одном варианте патогенных и в другом варианте непатогенных грибов в равных количествах (400 кг/л) при идентичных условиях содержания в первом случае через 10 сут. произошла 100%-ная гибель рыб, во втором случае гибели рыб не было.

Указанные факторы подтверждают, что только количественная характеристика грибов вида C.guiliiermondil в корме не позволяет дать всестороннюю достоверную оценку санитарного состояния корма, особенно в тех случаях, когда их количество в корме менее установленной нормы.

Цель изобретения - повышение точности определения патогенное™ искусственных кормов,

Для достижения поставленной цели готовят навеску исследуемого корма, например, 10 г, помещают в колбу и добавляют 90 мл стерильного физиологического раствора, получая разведение 1:10.

После взбалтывания колбы на шуттель- оппарате в течение 15-20 мин стерильной пипеткой отбирают 1 мл взвеси и переносят в пробирку с 9 мл стерильного физиологического раствора, получая разведение 1:100, Разведение 1:1000, 1:10000 получали аналогичным образом. Из полученных разведений делают высевы в чашки Петри со средней Сабуро в количестве 1 мл. Посевы инкубируют в термостате при 27°С в течение 48 - 72 ч, после чего производят количе- ственный учет выделенных грибов и сравнивают полученные данные с предельно допустимой нормой .их содержания 500 клеток/г.

В случае превышения указанной предельно допустимой нормы, корм считают непригодным для скармливания рыбам.

При содержании грибов вида C.gullllermondi в 1 г корма менее допустимой нормы, т.е. менее 500 кл/г дополнительно определяют количество грибов, обладающих дезоксириб.онуклеазной активностью.

Для этого грибы высевают на ДНКаз- ный агар в чашки Петри, которую затем помещают в термостат и инкубируют в течение 1 сут при 4 + 27°С. Через сутки инкубации чашку Петри извлекают и наносят на поверхность среды пипеткой 3 мл 1 н. раствора соляной кислоты, которая осаждает только полимерную дезоксирибонуклеиновую кислоту агара, в результате чего последний приобретает матовую окраску.

Дезоксирибонуклеиновая кислота, деполимеризованная деэоксирибонуклеазой грибов, не осаждается соляной кислотой, в результате чего вокруг колонии грибов образуется прозрачная зона деполимеризации, диаметр которой измеряют и при

0 полученных значениях диаметра зоны деполимеризации 2 мм и более культуру грибов считают обладающей дезоксирибонуклеаз- ной активностью патогенной.

Затем определяют количество патоген5 ных грибов в навеске. Если это количество составляет более 5% от общего количества -клеток, гриба, корм считают патогенным и непригодным для-использования.

П р и м е р 1. Из партии искусственного корма для карповых рыб марки ПКВР выде0 ляли в соответствии с Методами исследования в ветеринарной микологии грибы вида C.gullliermondi и определяли их количество в 1 г корма. Оно составило 0,5 тыс,клеток, т.е. корм, в соответствии с известным способом пригоден для скармлива5 иия рыбам. Полученные колонии грибов помещали на ДН Казный агар в чашки Петри и инкубировали в течение суток в термостате при +27° С.

По истечении указанного срока чашку Петри вносили 3 мл 1 н. раствора НС и

0 определяли зону деполимеризации на ДНКазном агаре. Она составила 0,7 мм, т.е. дезокеирибонуклеазная активность отсутствует. На основании полученных результатов был сделан вывод о том, что указанные

5 грибы непатогенны.

Для подтверждения данного вывода указанную партию корма использовали при кормлений карпов в бассейне, Количество рыб в бассейне 20 шт., средний вес 150 г. Гидрологические условия содержания соот0 ветсгвовали норме.

По истечении 10,20 и 30 сут кормления исследовали состояние внутренних органов рыб. Отклонений от нормы не выявлено,

На основании оценки результатов исследования патогенности грибов и влияния

5 их количественного содержания на состояние внутренних органов рыб был сделан окончательный вывод о пригодности данной партии корма для скармливания.

Пример 2. В условиях эксперимента, аналогичных предшествующему примеру из

0 другой партии корма, выделены грибы того же вида в количестве 0,6 тыс.клеток в 1 г корма. Под воздействием этих грибов на

ДНКазный агар зона деполимеризации вокруг колоний составила также 0,7 мм, на основании чего был сделан вывод об их непатогенности.

Данный корм скармливали в течение 30 сут карпам в условиях, аналогичных предшествующему примеру.

Патолого-анатомические исследования внутренних органов на этапах 10-20 сут не показали отклонений от нормы. На этапе 30 сут была выявлена анемия жабер, почек и печени, на основании чего был сделан вывод, что причина проявления патогенных свойств грибов, которые изначально были непатогенны - их количественное содержание в 1 г корма 0,6 тыс.клеток, или на 20% больше, чем в предыдущем примере т.е. ре- зультаты данного опыта еще раз подтверди- ли правильность установленной в прототипе предельно допустимой нормы содержания грибов данного вида в 1 г корма.

П р и м е р 3. В условиях эксперимента, аналогичных примеру 1 количество грибов 1 корма составляло 0,4 тыс.клеток. Зона деполимеризации ДКНазного агара вокруг коло- ний грибов составила 2,4 мм.

После скармливания корма в течение 10 и 20 сут карпам-годовикам патол о го-анатомические исследования не выявили отклонений внутренних органов от нормы.

По истечении 30 сут была выявлена ане- мия жабер, почек и печени, т.е. в данном случае причина указанных явлений заключается в изначальной патогенное™ самих грибов, так как количественное содержание их в 1 г корма менее установленной пре- дельно допустимой нормы.

П р и м е р 4. В условиях эксперимента, аналогичных предшествующему примеру, зона деполимеризации ДНКазного агара вокруг колонийтрибов составила 2,5 мм.

В данном случае анемия внутренних органов проявилась уже на 20 сут скармлива- ния корма, т.е. при одинаковом с предшествующим примером количестве грибов в 1 г корма решающее влияние на патогенез у рыб оказывает изначальная па- тогенность грибов.

Результаты экспериментов отражены в табл.1.

Во второй серии экспериментов уста- навливали количество патогенных грибов в навеске, которое может негативно влиять на физиологическое состояние рыб.

П р и м е р 5. Двадцати рыбам перораль- но вводили суспензию, содержавшую 400 + 7 клеток грибов C.guilliermondii, т.е. менее предельно допустимой нормы (500 кл/л), среди которых 5% составляли грибы, обладавшие активностью дезоксирибонуклеазы, т.е. патогенные (зона деполимеризации ДНКазного агара грибами составляла 2,4 мм).

Суспензию вводили рыбам в течение 30 сут и результаты оценивали по физиологическому состоянию рыб.

У данной группы рыб в течение всего эксперимента не наблюдалось достоверных отклонений от нормы по поведенческим реакциям и в весе, гибели рыб не было, т.е. данное количество грибов в корме, несмотря на патогенность, не оказывает достоверно негативного влияния на. организм рыб, очевидно, не подавляя его резистентность.

Пример 6. В условиях эксперимента, аналогичных предшествующему примеру, количество патогенных грибов составляло 7%. У рыб данной группы после 20 сут опыта наблюдалось угнетение реактивной способности и достоверное снижение веса к исходу 30 сут.

Гибели рыб не наблюдалось.

Пример. В условиях эксперимента,

аналогичных предшествующим примерам,

количество патогенных грибов в суспензии

.увеличили до 10 %. В результате на 30 сут

опыта наступила гибель 10% рыб.

П р и м е р 8 и 9. В условиях экспериментов, аналогичных предшествующим примерам, количество патогенных грибов в суспензии увеличивали до 20 и 30%. Гибель рыб составила 35 60% соответственно.

Результаты этой серии экспериментов сведены в табл.2. Зависимость физиологического состояния рыб от содержания патогенных грибов вида C.guilliermondii в предельно допустимой норме их общего количественного содержания в 1 г корма.

Из данных табл.2 очевидно, что если в 1 г корма содержится грибов вида C.guilliermondii менее 500 клеток, среди которых более 5% составляют патогенные грибы, т.е. . обладающие активностью дезоксирибонуклеазы, такой корм патогенен и непригоден для использования. Скар- мливание его рыбам приводит к последовательному угнетению поведенческих реакций, снижению веса рыб и к коматозному состоянию и гибели.

Формула изобретения

Способ определения патогенности искусственных комбикормов для карповых рыб. предусматривающий приготовление навески исследуемого корма, равной 1 г, последующее определение в ней количества клеток гриба Candida guillermondii и отнесение исследуемого корма к патогенным в случае наличия более 500 клеток гриба в навеске, отличающийся тем, что, с

целью повышения точности определения, в корме, содержащем менее 500 клеток гриба на 1 г, дополнительно определяют количество грибов, обладающих дезоксирибонулеаз- ной активностью и патогенным считают

исследуемый корм в случае наличия в навеске более 5% от общего количества клеток гриба, обладающих дезоксирибонуклеаз- ной активностью.

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано в рыбоводстве для определения патогенности искусственных комбикормов. Целью изо бретения является повышение точности определения. В корме, содержащем менее 500 клеток гриба Candida guHlermondfl на 1 г определяют количество грибов, обладающих дезоксирибонуклеазной активностью. Патогенным считают корм в случае наличия в 1 г корма более 5% от общего количества клеток гриба, обладающих дезоксирибонуклеазной активностью. 2 табл.

Таблица1