Способ определения миграции лимфоцитов в организме Советский патент 1992 года по МПК G01N1/30 

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для изучения закономерностей участия лимфо- идных клеток в механизме патологических и физиологических процессов.

Цель изобретения - повышение точности способа.

Указанная цель достигается за счет того, что трансплантируемые лимфоциты метят акридиновым оранжевым при °С в течение 30 мин в темноте, а регистрацию клеток проводят люми- нисцентным методом.

Изобретение осуществляется следующим образом.

Суспензию донорских лимфоцитов (5-107 - 8-107 клеток в 1 мл) инкубируют 30 мин в растворе акридинового оранжевого (1: 0000°) при 4°С в темноте. Затем клетки отмывают, пропуская суспензию через колонку с. активированным углем. В полученной взвеси окрашенных клеток подсчитывают количество ядросодержащих элементов общепринятыми методами. При наличии в суспензии 95% живых лимфоцитов суспензию вводят внутривенно реципиентам, которых забивают через 1,5 ч. Навеску исследуемого органа измельчают в физиологическом растворе и готовят мазки, которые просматривают под люминисцентным микроскопом, совмещенным с фазовоконтрастным устройством . В мазках определяют соотношение клеток, меченных акридиновым оранжевым (АО) и светящихся в ультрафиолете, ко всем ядросодер- жащим клеткам в поле зрения, причем последние подсчитывают в видимом свете. Затем рассчитывают процент меченых клеток, находящихся в органе, от общего количества трансплантируемых лимфоцитов по формуле

(/)

|

со

го

to to at

B-C-D

100,

где А В

измеряемый показатель; количество лимфоцитов, мече- ных АО, приходящихся на шесть просчитанных клеток в мазке;

вес исследуемого органа, мг; количество ядросодержащих клеток в навеске органа (10);

навеска исследуемого органа, мг;

количество введенных реципиенту лимфоцитов, меченых АО (Юб); общее количество клеток, подсчитанных в мазке. Пример 1 о Сравнивают миграцию интактных лимфоцитов меченых АО и Gr „ Для мечения лимфоцитов Gr5I к 2-3 мл суспензии клеток добавляют 0 4 с удельной активностью 3,7 tOT Бк/мл из; расчета 1,8д 10б Бк/105 кл/мл, инкубируют 30 мин при 37°С, периодически встряхивая. Трижды отмывают в k-S мл среды Хенк- са без фенолового красного. Реципиентам внутривенно вводят 1,0 мл суспензии, содержащей 5 Ю7 - жизнеспособных клеток с общей активностью околог «103 Бк. Радиометрию проб проводят на автоматическом счетчике N1L-603 (ЧСР). Процент меченых клеток, находящихся в органе, от общего количества трансплантированных лимфоцитов рассчитывают по формуле

С D

Е F G 1732225

менения содержания метки АО и Gr

0

в лимфоцитах при культивировании in vitro при 37 С Эти параметры оценивают после приготовления суспензии лимфоцитов сразу после мечения клеток АО и через 1,5 3 и 5 ч культивирования меченых клеток в среде Хенкса без фенолового красного и эмбриональной телячьей сыворотки Перед (каждым анализом проводят двухкратное смывание клеток центрифугированием по 10 мин при 50 g с ресуспендированием в изначальном

5 объеме питательной среды

Изучение количества ядросодержащих элементов в суспензиях лимфоцитов, меченых АО и и немеченых - (контроль), не выявляет различий меж0 ду сравниваемыми группами в избранные сроки наблюдения. В табл.1 приведено количество ядросодержащих элементов в суспензиях лимфоцитов при культивировании в среде Хенкса

5 (10е мл/я)о На основании полученных данных можно полагать, что ни АО, ни Gr при заданных условиях эксперимента не вызывают структурного разрушения лимфоцитов и не отличаются по

0 этому критерию друг от друга. Отме чаемое во всех трех сериях эксперимента уменьшение количества ядросодержащих элементов обусловлено неспецифическими причинами и связано с условиями культивирования и манипулирования с суспензиями и является характерным для моделей in vitro.

5

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для определения миграции лимфоцитов в организме. Цель изобретения - повышение точности способа. Для этого животным-реципиентам вводят лимфоциты меченые люминесцентным красителем акридиновым оранжевым и затем проводят подсчет количества меченых клеток в исследуемом органе. табл.

А 2 100%,

54

8 С Я

где А - процент меченых Gr лимфоцитов в органе от общего коч личества введенных лимфоцитов;

радиоактивность исследуемого органа;

общая радиоактивность введенной суспензии меченых Gr лимфоцитов.

Сравнивают миграцию интактных лимфоцитов, меченых АО и Gr51 в костный мозг одной бедренной кости, .печень, почки, селезенку, подчелюстные слюнные железы через 1,5ч после внутривенной трансплантации ин- тактным реципиентам Кроме того, про бодят сравнение количества ядросо- держащих элементов описанным методом, количества жизнеспособных клеток по тесту с трипановым синим, из-

В табЛо2 показана жизнеспособность лимфоцитов по тесту с трипоно- вым синим при культивировании в среде Хенкса (%)„

-

45

Исследование жизнеспособности меченых клеток выявляет снижение этого показателя во всех сериях эксперимента, что также связано с условиями культивирования лимфоцитов. Однако при этом наибольшее количество не- 5Q, жизнеспособных лимфоидных клеток во все сроки наблюдения выявляется при мечении их Gr5t , Метка ,АО не поиво- дит к увеличению процента нежизнеспособности клеток в сравнении с контролем Таким образом, мечение лимфоцитов Gr51 сопровождается нарушением их жизнеспособности, в то время как мечение их АО подобного эффекта не вызывает.

55

51

В табл.3 показано изменение содер жания метки в лимфоцитах при культивировании в среде Хенкса,

Если при мемении лимфоцитов АО метка присутствует во всех клетках во все сроки наблюдения, то при мече- нии их Gr5 отмечается достоверное снижение радиоактивности проб, начиная с 1,5 ч культивированияс Снижение радиоактивности связано не только со снижением числа лимфоцитов в пробах, но и со спонтанной потерей Gr5 клетками в динамике культивирования, так как пересчет радиоактивности проб на 10Г клеток суспензии также показал ее достоверное падение,

Сравнение результатов распределения в организме реципиентов трансплантированных лимфоцитов, меченых АО и ,- дает результаты, приведенные в Если общий характер распределения меченых АО лимфоцитов существенно не отличается от данных прототипа то доля меченых АО лимфоцитов, мигрировавших в органы, во всех случаях ниже, чем при их метке Gr |«, Анализ экспериментальных данных позволяет считать, что в данном случае применение способа прототипа приводит к завышению реального количества мигрировавших в орган лимфоцитов Подобное завышение, приводящее к ошибке в исследовании, связано как с частичной утерей метки отдельными клетками, так и с утратой определенным количеством лимфоцитов жизнеспособности, выявленными ранее. Это приводит к усилению реутилизации клетками реципиента и неспецифическому распределению метки в организме,, Метка задерживается в органах с богатым кровоснабжением и большим числом клеток, способных в фагоцитазуо Причем показано, что преимущественно Gr51 задерживается в печени за счет поглощения его мак

32225 (6

рофагами, Последнее подтверждается полученными данными (см,табл.М, свидетельствующими о том, что повышенно 5 B суспензии доли нежизнеспособных

лимфоцитов, меченых АО, путем их нагревания, приближает результаты, полученные предлагаемым способом к данным прототипа

10 Из этого следует, что косвенный подсчет распределения трансплантированных лимфоцитов у реципиентов по радиоактивности органов менее точен из-за существенного неспецифическо16 го распределения метки в организме. В предлагаемом способе лечение лимфоцитов АО не сопровождается утерей метки и снижением жизнеспособности меченых лимфоцитов. Кроме того, при исполь20 зовании предлагаемого способа в органе учитываются меченые клетки, а не количество метки, как в прототипе

Таким образом, данные сопоставительного анализа, полученные по результатам выполнения предлагаемого и известного способов, подтверждают повышение точности способа Кроме того, предлагаемый способ позволяет

30 значительно упростить и снизить стоимость его выполнения, он более эффективен

25

Формула изобретения

Способ определения миграции лимфоцитов в организме, путем мечения лимфоцитов, их трансплантации в организм с последующим выявлением метки в органах, отличающийся тем, что, с целью повышения точности и упрощения способа, в качестве метки используют краситель акридиновый оранжевый, мечение лимфоцитов проволят в течение 30 мин при °С в темноте, а выявление метки проводят по ее люминисценции.

Примечание Число проб п 10 во всех случаях.

Таблица2

После приготовления

суспензии лимфоцитов 97,640,30

Сразу после метки97,310,52

Через 1,5ч после

метки90,311,02

Через 3 ч после

метки, В, ,43

Через 5 ч после

метки79,511,33

Лостоверность различий между опытными группами ,05. Достоверность различий с контролем ,05,

ТаблицаЗ

Сразу после мет ки лимфоцитов

Через 1,5ч после метки

Через 3 ч после метки

100 1,0010,151000,30310,011 100

1003,24+0,1981,012,88 0,27010,010 89,143,И

100 2,6310,,,15 0,26240,009 86,5±2,87

Таблица 1

97,610,5597,910,20

9б,8+0,,510,25

88,711,5283,311,10

20,111,,5Ј0,98

76,912,0166,711,12

Через 5 ч после метки

100 2,3010,10 57,5±2,0 0,2510,010 83,,5

Досто6ерность отличий с исходным уровнем ,05

Метка лимфоцитов Метка лимфоцитов АО.

Продолжение табл.3.

таблиц 1