СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ТУБЕРКУЛЕЗНЫХ ГРАНУЛЕМ В КУЛЬТУРЫ in vitro Российский патент 2012 года по МПК G01N1/00 G01N33/48 C12N1/20 C12R1/32 

Изобретение относится к экспериментальной биологии и медицине, а именно к способам эксплантации и культивирования гранулем in vitro, и может быть использовано при разработке и оценке эффективности средств лечения туберкулеза, осложненного гранулематозным туберкулезным процессом (некроза, фиброза), а также при разработке новых иммунотропных препаратов, регулирующих функциональную активность клеток гранулем и повышающих их противотуберкулезную активность.

Известен способ выделения шистосомных гранулем, включающий индукцию гранулематозного воспаления путем внутрибрюшинного инфицирования экспериментальных животных (мышей СВА/J) церкариями шистосом (Schistosoma mansoni), выделение печени через период времени, достаточный для формирования в ней гранулем (8 недель), приготовление гомогената ткани печени путем ее механической дезинтеграции с помощью блендера Waring на малой скорости, отмывание гомогената несколько раз в буферном растворе RPMI 1640 путем спонтанного осаждения, выделение гранулем из гомогената путем центрифугирования охлажденного до +4°С гомогената при 350 g в течение 5 мин, помещение осадка, содержащего гранулемы, в питательную среду для культивирования гранулем (1). Недостатком известного способа является его неприменимость для выделения туберкулезных гранулем. Это обусловлено тем, что в отличие от шистосомных гранулем, клетки которых прочно сцеплены друг с другом коллагеновыми волокнами, туберкулезные гранулемы не обладают такой прочностью и разрушаются при измельчении ткани печени либо захватываются вместе с участками ткани, с которой они прочно сцеплены.

Известен способ выделения и эксплантации шистосомных гранулем в культуры in vitro, включающий индукцию гранулематозного воспаления путем внутрибрюшинного инфицирования экспериментальных животных (мышей C57BL/6) церкариями шистосом (Schistosoma japonicum), выделение печени через период времени, достаточный для формирования в ней гранулем (6 недель), приготовление гомогената ткани печени путем ее механической дезинтеграции в течение 15 сек с помощью блендера в 10 объемах буферного раствора Хенкса, отмывание гранулем в холодном буферном растворе Хенкса, выделение гранулем из гомогената путем центрифугирования охлажденного гомогената при 200 g до тех пор, пока супернатант не станет прозрачным, помещение гранулем в питательную среду для культивирования (2). Известный способ обладаем теми же недостатками.

Наиболее близким к заявленному является способ выделения туберкулезных гранулем, включающий индукцию гранулематозного воспаления путем внутрибюшинного инфицирования экспериментальных животных (мышей) микобактериями М. avium, извлечение печени через период времени, достаточный для формирования в ней гранулем, механическую дезинтеграцию ткани печени путем осторожного растирания ее между двумя охлажденными предметными стеклами (между их шлифованными поверхностями), приготовление гомогената ткани печени в буферном растворе Хенкса, очистку гомогената от крупных фрагментов ткани путем спонтанного осаждения, удаление осадка, выделение гранулем из надосадочной суспензии путем последующего трехкратного центрифугирования при 150 g с последовательным удалением супернатанта и растворением осадка с гранулемами в новой порции буферного раствора Хенкса; помещение выделенных гранулем в среду для культивирования (3). Недостатком известного способа является то, что использование печени в качестве источника гранулем не позволяет выделить «чистые гранулемы» без примесей. Это обусловлено значительной интеграцией гранулем в ткани печени, высокой плотностью печени, что не позволяет выделить даже наиболее прочные и компактные фиброзированные туберкулезные гранулемы неповрежденными, поскольку процесс дезинтеграции должен быть очень «жестким». По этой причине в известном способе используют предметные стекла со шлифованной поверхностью в качестве средств механической дезинтеграции туберкулезных гранулем, что приводит к значительным структурным повреждениям гранулем, выражающимся в нарушении их целостности. Кроме того, ввиду высокой степени сцепленности гепатоцитов печени среди гранулем при их механическом выделении встречается большое количество фрагментов ткани печени, соизмеримых по размерам с гранулемами, что делает процесс фракционирования чистой суспензии гранулем весьма проблематичным. Другим недостатком способа является наличие в выделенных гранулемах примесей в виде большого количества эритроцитов, лимфоцитов и макрофагов. Это обусловлено тем, что центрифугирование гомогената (после осаждения из него крупных кусков ткани) при 150 g приводит к осаждению данных клеток вместе с гранулемами, что не позволяет получить чистые гранулемы

Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является более эффективное сохранение целостности гранулем, повышение чистоты их выделения.

Решение поставленной задачи достигается тем, что для выделения гранулем используют ткань селезенки, надосадочную суспензию, содержащую гранулемы, центрифугируют в градиенте ускорений 15-28 g; осаждение крупных фрагментов ткани из гомогената и разведение осажденных гранулем после каждого центрифугирования осуществляют в культуральной среде; механическую дезинтеграцию ткани селезенки производят путем измельчения на фрагменты размером 0,5-1 мм; каждое центрифугирование надосадочной суспензии осуществляют в течение 2-5 мин; выделение селезенки осуществляют через 30-90 дней после инфицирования;

Описание сущности изобретения

Способ получения экспериментальных туберкулезных гранулем в культуре in vitro осуществляют следующим образом.

Экспериментальным животным, например мышам, внутривенно вводят микобактерии вакцины БЦЖ для индукции системного туберкулезного воспаления. После формирования экспериментальных туберкулезных гранулем (через 30-90 дней с момента заражения) животных забивают с соблюдением правил проведения работ с экспериментальными животными с использованием наркоза. Извлекают селезенку с соблюдением асептических условий и проверяют образец селезенки на наличие индуцированных гранулем, например, методом флуоресцентного или гистохимического анализа. Затем проводят механическую дезинтеграцию ткани селезенки путем измельчения на фрагменты размером 0,5-1 мм с помощью режущего инструмента, например скальпеля. Переносят измельченную ткань селезенки в среду для культивирования и гомогенизируют путем встряхивания, например, на шейкере, в течение 1-3 мин. Проводят очистку гомогената от крупных фрагментов ткани селезенки путем спонтанной седиментации в течение 1-2 мин в культуральной среде. Удаляют осадок. Для выделения гранулем полученную надосадочную суспензию центрифугируют при ускорении 15-28 g в течение 2-5 мин. Осадок, содержащий гранулемы, ресуспензируют в новой порции культуральной среды, повторяют процедуру при указанном режиме центрифугирования не менее двух раз. Это позволяет очистить гранулемы от примесей различных клеток (эритроцитов, лимфоцитов, избытка макрофагов). Полученный осадок, содержащий гранулемы, разводят в среде для культивирования, культивируют при стандарных условиях при температуре 37°С в атмосфере, содержащей 5% CO₂.

Преимущество использования селезенки в качестве органа для выделения гранулем заключается в том, что гранулемы менее интегрированы в ткани селезенки, что дает возможность избежать их разрушения на стадии извлечения и механической дезинтеграции ткани селезенки. Кроме того, использование селезенки позволяет выделять БЦЖ-индуцированные гранулемы на всех стадиях их развития, в том числе до начала фиброзирования.

Выделение гранулем целесообразно проводить через 30-90 дней после заражения. На ранних стадиях (к 30 дню) в селезенке формируются полноценные гранулемы, в этот период адгезивные контакты между клетками гранулемы достаточны для сохранения целостности гранулем при их выделении (они не «рассыпаются»). Увеличение срока формирования гранулем может быть осуществлено для изучения морфогенеза и развития гранулем на более поздних стадиях вплоть до стадии фиброзирования.

Замена гомогенизации путем растирания между стеклами (см. в описании прототипа) на механическое измельчение на фрагменты размером 0,5-1 мм способствует сохранности гранулем и повышению чистоты их выделения, т.к., с одной стороны, их размеры от 60 до 125 мкм, существенно меньше указанных фрагментов ткани; с другой стороны, измельчение на фрагменты указанной величины позволяет освободить гранулемы от крупных кусков ткани селезенки.

Выбор градиента ускорения 15-28 g и длительности центрифугирования экспериментально подобраны таким образом, чтобы осадить гранулемы из гомогената раньше, чем в осадок выпадут находящиеся в гомогенате эритроциты, лимфоциты и макрофаги, последние удаляются вместе с надосадочной жидкостью, а не выпадают в осадок вместе с гранулемами, как в способе-прототипе, что существенно повышает чистоту выделения гранулем. При этом скорость вращения ротора центрифуги при одном и том же ускорении зависит от модели центрифуги, а точнее от радиуса ее ротора, и определяется по известной формуле G=(2·π·f)²·R, где R - радиус вращения (ротора или орбиты тела), f - скорость вращения в оборотах в секунду. Например, при использовании центрифуги скорость вращения, соответствующая ускорению 15 g, составляет 400 оборотов в минуту.

Методом оценки жизнеспособности клеток, основанным на прижизненной окраске трипановым синим, показано, что 99,5% клеток в гранулемах сохраняют жизнеспособность. По данным компьютерной морфометрии цифровых фотографий гранулем, эксплантированных в культуру, показано, что культура гранулем не содержит эритроцитов и лимфоцитов, а количество макрофагов крайне невелико.

Количество свободных макрофагов в суспензии гранулем при их выделении по заявленному способу варьирует от 2-3 до 10-15 на одну выделенную гранулему или от 20 до 150 макрофагов на 1 мл суспензии и зависит от числа отмываний гранулем путем центрифугирования в растворе культуральной среды и от индивидуальных особенностей животного. При увеличении числа указанных процедур можно достичь практически полного отсутствия макрофагов в составе гранулем. Однако наличие небольшого количества макрофагов способствует улучшению условий культивирования гранулем и увеличивает вероятность их приживления в культуре.

Использование в заявленном способе культуральной среды (вместо буферного раствора Хенкса в прототипе) на стадии спонтанного осаждения крупных фрагментов ткани из гомогената и на стадии центрифугирования способствует повышению жизнеспособности гранулем.

Другим преимуществом заявленного способа является возможность его осуществления без применения дорогостоящих реактивов, что позволяет широко использовать его в практике научных исследований иммунопатологических механизмов гранулемогенеза при развитии туберкулезного процесса, изучении иммунологических механизмов, регулирующих процессы образования и эволюции гранулем при инфекционных гранулематозных воспалительных процессах, при поиске, разработке и изучении новых противотуберкулезных препаратов.

Примеры конкретного выполнения

Пример 1

Мышам линии BALB/c вводили внутривенно микобактерии вакцины БЦЖ (0,5 мг в 0,25 мл физиологического раствора). Через 30 дней после инъекции у мышей было индуцировано системное хроническое воспаление, моделирующее генерализованное туберкулезное воспаление. Мышь забивали после легкого эфирного наркоза методом цервикальной дислокации. Селезенку извлекали, соблюдая асептические условия получения биологических образцов ткани для культивирования (в ламинарном боксе «Клиника-572»), и помещали в стерильную пластиковую чашку Петри (с диаметром 40 мм), в которую предварительно вносили 1 мл культуральной среды, а именно среды альфа-МЕМ, содержащей 5% сыворотки эмбрионов коров.

Небольшие фрагменты селезенки (1-2 мм) отсекали скальпелем для последующего морфологического анализа. Наличие типичных БЦЖ-индуцированных гранулем в селезенке было верифицировано методом флуоресцентного анализа (на микроскопе AxioI-mager Z1, Zeiss) фрагмента селезенки, окрашенного акридиновым оранжевым, а также в результате последующего анализа образца селезенки стандартным методом гистологического анализа (по традиционной схеме, включающей фиксацию формалином, получение парафиновых срезов, их депарафинизацию, окраску гематоксилином и заключение в бальзам).

Содержимое селезенки освобождали от капсулы и проводили предварительную механическую гомогенизацию селезеночной ткани непосредственно в чашке Петри в 1 мл указанной среды для культивирования путем измельчения с помощью скальпеля на фрагменты размером 0,5-1,0 мм. Далее предварительно гомогенизированную ткань селезенки помещали во флакон с рабочим объемом на 20 мл, вносили в него 9 мл указанной среды для культивирования и встряхивали на шейкере при частоте 20 Гц в течение 1 мин. Затем гомогенат в виде суспензии, содержащей эритроциты, спленоциты, гранулемы и более крупные фрагменты недезинтегрированной селезеночной ткани, переносили в центрифужную пробирку на 10 мл, оставляли на 1 мин для осаждения крупных фрагментов недезинтегрированной селезеночной ткани. Надосадочную суспензию, содержащую эритроциты, спленоциты, гранулемы в объеме 10 мл центрифугировали при ускорении 15 g в течение 5 мин. Надосадочную жидкость сливали, осадок ресуспензировали в новой порции указанной культуральной среды. Процедуру повторяли дважды, при этом длительность второго центрифугирования составила 5 мин, третьего - 3 мин. Полученный осадок, содержащий гранулемы, разводили в среде для культивирования и вносили в пластиковые планшеты для культивирования, в которые предварительно помещали покровные стекла. Культивирование осуществляли на основе стандартной процедуры: при температуре 37°С в атмосфере, содержащей 5% CO₂.

Размеры выделенных из селезенки гранулем, эксплантированных в культуры, варьировали от 50 до 70 мкм в диаметре, что отражает различные стадии гранулематозного процесса.

Количество гранулем в суспензии составило величину 19 гранулем/мл без морфологических признаков нарушения их целостности (целостность - 100%), при этом эритроциты и лимфоциты отсутствовали, а содержание макрофагов было небольшим (85 клеток на 1 мл суспензии).

Пример 2

Заявленный способ осуществляли аналогично описанию в примере 1, с тем отличием, что селезенку выделяли через 90 дней после инфицирования. Каждое центрифугирование проводили трижды при стартовом ускорении 28 g в течение 2 мин.

Методом оценки жизнеспособности клеток, основанной на прижизненной окраске трипановым синим, показано что 99,5% клеток в гранулемах сохраняют жизнеспособность. По данным компьютерной морфометрии цифровых фотографий гранулем, эксплантированных в культуру, размеры выделенных из селезенки гранулем, эксплантированных в культуры, варьировали от 60 до 125 мкм в диаметре, что отражает различные стадии гранулематозного процесса.

Количество гранулем в суспензии составило величину 21 гранулем/мл, доля гранулем без морфологических признаков нарушения целостности - 86%, содержание макрофагов - умеренное (175/мл суспензии).

Пример 3

Заявленный способ осуществляли аналогично описанию в примере 1, с тем отличием, что селезенку выделяли через 60 дней после инфицирования. Каждое центрифугирование проводили 4 раза при ускорении 15 g в течение 5 мин. Это позволило выделить чистые гранулемы, практически не содержащие макрофагов, поврежденных спленоцитов и других сопутствующих клеток, что бывает необходимо для последующих научных исследований при изучении факторов, продуцируемых собственно гранулемами.

Количество гранулем в суспензии составило величину 20 гранулем/мл суспензии, доля гранулем без морфологических признаков нарушения целостности - 90%, содержание макрофагов очень низкое (15/мл суспензии).

Источники информации

Изобретение относится к экспериментальной биологии и медицине, а именно к способам эксплантации и культивирования гранулем in vitro, и может быть использовано при разработке и оценке эффективности средств лечения туберкулеза, а также при разработке новых иммунотропных препаратов. Способ получения экспериментальных туберкулезных гранулем в культуре in vitro включает индукцию гранулематозного воспаления путем инфицирования экспериментальных животных микобактериями БЦЖ, выделение и механическую дезинтеграцию тканей селезенки, содержащего гранулемы, через период, достаточный для их формирования в организме животного, гомогенизацию ткани селезенки в растворе путем встряхивания, очистку гомогената от крупных фрагментов ткани спонтанным осаждением в культуральной среде, удаление осадка, выделение гранулем из надосадочной суспензии, их отмывание в новой порции культуральной среды путем центрифугирования при ускорении 15-28 g не менее трех раз и перенесение осажденных гранулем в среду для культивирования. Изобретение обеспечивает эффективное сохранение целостности гранулем и повышение чистоты их выделения. 3 з.п. ф-лы, 3 пр.

1. Способ получения экспериментальных туберкулезных гранулем в культуре in vitro, включающий индукцию гранулематозного воспаления путем инфицирования экспериментальных животных микобактериями БЦЖ, выделение и механическую дезинтеграцию тканей органа, содержащего гранулемы, через период, достаточный для их формирования в организме животного, гомогенизацию ткани органа в растворе путем встряхивания, очистку гомогената от крупных фрагментов ткани спонтанным осаждением в физиологически приемлемом растворе, удаление осадка, выделение гранулем из надосадочной суспензии и их отмывание в физиологически приемлемом растворе путем центрифугирования не менее трех раз; перенесение осажденных гранулем в среду для культивирования, отличающийся тем, что для выделения гранулем используют ткань селезенки, надосадочную суспензию, содержащую гранулемы, центрифугируют при ускорении 15-28 g; осаждение крупных фрагментов ткани из гомогената и разведение осажденных гранулем после каждого центрифугирования осуществляют в культуральной среде.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что механическую дезинтеграцию ткани селезенки производят путем измельчения на фрагменты размером 0,5-1 мм.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что каждое центрифугирование надосадочной суспензии осуществляют в течение 2-5 мин.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что выделение селезенки осуществляют через 30-90 дней после инфицирования.