СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АКТИВАТОРА ПЛАЗМИНОГЕНА Советский патент 1995 года по МПК A61K38/48 C12N9/68 C12N5/06 

Изобретение относится к области медицины, а именно получению аналитических препаратов,и может быть использовано в физиологии, биохимии, фармакологии, цитологии.

Известен способ получения активатора плазминогена из среды культивирования ряда линий монослойных культур клеток, в том числе из почки эмбриона свиньи (СПЭВ) в присутствии пептона, заключающийся в выращивании культуры в течение длительного времени с последующим добавлением в среду культивирования пептона.

Однако такой способ длителен (свыше 21 сут), выход целевого продукта лишь с узкой активностью активатора плазминогена.

Целью изобретения является получение препарата с широким спектром фибриндеполимеризационных свойств неферментативной фибринолитической активностью, активностью активатора плазминогена и дезагрегирующими свойствами в отношении фибрин-мономера.

Эта цель достигается тем, что клетки, выращенные в течение 3-4 сут, подвергают осмотическому шоку в дистиллированной воде (70-80 мл на 1,5-литровый матрац), клеточную массу осаждают центрифугированием при 7000-8000 об/мин в течение 10-15 мин, осадок подвергают дополнительной обработке небольшим объемом (10-20 мл) дистиллированной воды, центрифугируют, полученные супернатанты объединяют.

Способ осуществляют следующим образом.

Клетки монослойной перевиваемой культуры СПЭВ выращивают при 37^оС в течение 3-4 сут в 1,5-литровом матраце на среде 199 с с добавлением 10%-ной сыворотки крови крупного рогатого скота, после чего удаляют среду и добавляют 70-80 мл дистиллированной воды. Далее производят встряхивание в течение 40-60 мин, клеточные мембраны удаляют центрифугированием при 7000-8000 об/мин в течение 15-20 мин. В результате получают 70-80 мл надосадочной жидкости, представляющей собой целевой продукт, который хранят при температуре 4-6^оС в течение 4-5 сут. Все операции по выделению препарата можно проводить при комнатной температуре.

Для длительного (более полугода) использования полученного препарата его лиофильно высушивают.

Предлагаемый способ позволяет получать препарат, обладающий широким спектром фибринолитического действия за счет приобретения дополнительных активностей неферментативной фибринолитической и дезагрегирующей в отношении фибрин-мономера. Способ осуществляют без изменения дорогостоящих препаратов и аппаратуры в условиях биохимических лабораторий.

П р и м е р 1. Берут клетки перевиваемой культуры СПЭВ, помещают на три матраца со средой 199, содержащей 10%-ную сыворотку крови крупного рогатого скота, инкубируют при 37^оС в течение 3 сут, далее клетки подвергают осмотическому шоку, для чего добавляют в матрац 75 мл дистиллированной воды после слива среды, проводят взбалтывание в течение 60 мин, затем воду с клетками переливают в следующий матрац, процедуру повторяют, то же делают и с третьим матрацем, клеточную массу осаждают центрифугированием при 8000 об/мин в течение 15 мин. Клетки, находящиеся в осадке, заливают небольшим объемом дистиллированной воды (20 мл), взбалтывают в течение 20 мин и удаляют разрушенные клетки центрифугированием при 8000 об/мин в течение 15 мин. Полученные супернатанты объединяют и подвергают анализу.

В полученном целевом продукте определяют наличие активатора плазминогена на стандартных фибриновых пластинах (зоны лизиса 25 мм²), степень дезагрегирующей активности в отношении фибринмономера (43% ), неферментативную фибринолитическую активность в присутствии блокаторов ферментативного фибринолиза (зоны лизиса 60 мм²).

Следовательно, целевой продукт обладает одновременно тремя полезными активностями: дезагрегационной в отношении фибрин-мономера, неферментативной фибринолитической и активностью активатора плазминогена.

П р и м е р 2. Начальные операции проводят так же, как и в примере 1. В первый матрац добавляют 80 мл дистиллированной воды, проводят взбалтывание в течение 40 мин, затем воду с клетками переливают в следующий матрац, процедуру повторяют, то же делают и с третьим матрацем, клеточную массу осаждают центрифугированием при 7000 об/мин в течение 20 мин, далее осадок с клетками заливают дистиллированной водой (20 мл), взбалтывают в течение 20 мин. Полученные разрушенные клетки удаляют центрифугированием при 7000 об/мин в течение 20 мин. Полученные супеpнатанты объединяют и проводят анализ.

В полученном целевом продукте определяют наличие активатора плазминогена на стандартных фибриновых пластинках (зоны лизиса 30 мм²), степень дезагрегационной активности на нестабилизированном фибрине 40% неферментативную фибринолитическую активность в присутствии блокаторов ферментативного фибринолиза (зоны лизиса 56 мм²).

Следовательно, целевой продукт обладает одновременно тремя полезными активностями: дезагрегационной в отношении фибрин-мономера, неферментативной фибринолитической активностью и активностью активатора плазминогена.

П р и м е р 3. Начальные операции проводят, как и в примере 1, но инкубируют культуру при 36,5^оС в течение 4 сут. Остальные операции, как и в примере 1.

В полученном целевом продукте определяют наличие активатора плазминогена на стандартных фибриновых пластинах (зоны лизиса 69,5 мм²), степень дезагрегационной активности на нестабилизированном фибрине (13,3%), неферментативную фибринолитическую активность в присутствии блокаторов ферментативного фибринолиза (зоны лизиса 25 мм²).

Следовательно, целевой продукт обладает слабой фибринодезагрегационной активностью, но высоким уровнем активатора плазминогена.

Изобретение относится к области физиологии и биохимии свертывания крови и цитологии и может быть применено в фармакологии и экспериментальной медицине. Сущность изобретения заключается в том, культуру клеток почки что эмбриона свиньи выращивают в течение 3-4 сут, затем ее подвергают осмотическому шоку при встряхивании в дистиллированной воде в течение 40-60 мин, после чего клетки осаждают центрифугированием при 7000-8000 об/мин и отделяют супернатант. Целевой продукт обладает широким спектром фибриндеполимеризационной активности, включающей неферментативную фибринолитическую активность и активность активатора плазминогена. Способ более экономичен и прост.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АКТИВАТОРА ПЛАЗМИНОГЕНА, включающий культивирование культуры клеток почки эмбриона свиньи на среде 199 при температуре 36,5 - 37^oС с последующим отделением целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью расширения спектра фибриндеполимеризационных свойств препарата и сокращения времени его выделения, культивирование проводят в течение 3 4 сут, затем добавляют к культуре клеток дистиллированную воду и встряхивают смесь в течение 40 60 мин, после чего центрифугируют при 7000 8000 об/мин в течение 15 20 мин и отделяют супернатант.