Способ получения таннина листьев суммаха, обладающего интерферониндуцирующей активностью Советский патент 1992 года по МПК C07H13/02 

мегосин токсичны и их химико-терапевтический индекс значительно ниже такового предлагаемого вещества. Использование мегосина в качестве индуктора человеческого лейкоцитарного интерферона в больших масштабах препятствует нехватка донорской крови,

Цель изобретения - создание эффективного водорастворимого малотоксичного и относительно дешевого индуктора интерферона из растительного сырья, обладающего этим видом активности как при парентеральном, так и пероральном введении.

Поставленная цель достигается использованием таннина листьев любого из трех видов сумаха (Rhus glabra, Rh.typhina, Rh.coriaria), получаемого экстрагированием листьев 70%-ным водным ацетоном при 50- 55°С с последующей выпариванием водно- ацетонового экстракта, 3-кратной обработкой водного остатка сначала хлороформом в соотношении 1:3, затем этилаце- татом (5 раз) в том же соотношении, высушиванием этилацетатной вытяжки свежепрокаленным сернокислым натрием в те- чение 22-24 ч, концентрированием высушенной и отфильтрованной этилацетатной вытяжки под вакуумом при 38-40°С до небольшого объема и осаждением таннина 4-кратным объемом гексана или петро- лейного эфира. Отфильтрованный осадок, представляющий собой таннин в смеси с другими полифенолами, промывают гекса- ном или петролейным эфиром и высушивают в вакуум-сушильном шкафу при 45-50°С в течение 5 ч, Выход составляет 11-13% от воздушно-сухой массы. Полученный таннин для очистки от сопутствующих полифенолов хроматографируют на колонке с силикаге- лем.

Проведение сравнительное изучение интерферониндуцирующей активности таннина листьев сумаха, госсипола и мегосина (табл.1), а также их токсического и цитоток- сического действия {табл. 2 и 3). Так как таннин листьев сумаха хорошо растворим в воде (госсипол и мегосин в воде не растворимы) при исследовании на животных его растворяли в физиологическом растворе, а при проведении экспериментов с культурами ткани - в питательной среде.

Изучение интерферониндуцирующей активности предлагаемого препарата проводили на культурах клеток различного происхождения, так-как известно, что различные культуры клеток проявляют неодинаковую способность к продукции интерферона. Были использованы перевиваемые линии клеток трансформированных фибробластов мыши L-929, диплоидные клетки фибробластов эмбриона человека М-19 и лимфоцитарные культуры периферической крови человека.

5Как видно из табл. 1. предлагаемый препарат является высокоактивным индуктором интерферона как на культурах фибробластного типа, так и в лимфоцитах крови человека, и его активность значитель- 0 но выше активности госсипола.

По приведенным данным видно, что

таннин сумаха оказался нетоксичным при

максимально растворимых дозах, в то

время как прототип оказался токсичным в

5 дозе 100 мг/кг.

Из табл. 3 видно, что для L-клеток сравнительно менее токсичным оказался предлагаемый препарат, который даже в дозе 100 мкг/мл не оказывал заметного воздей- 0 ствия на культуру клеток в течение 24 ч.

Для установления оптимальныхусловий

экстракции (концентрация ацетона в экстрагенте, температура) были взяты навески

по 20 г. Определение выхода таннина про5 водили по известной методике.

Результаты приведены в табл. 4.

Установлено, что наиболее оптимально соотношение водный концентрат:хлоро- форм 3:1. При соотношении 4:1 извлечение 0 липофильных веществ неполное, что в дальнейшем приводит к осмолению экстракта при осаждении. Соотношение водный кон- центрат:хлороформ 1:1 или 2:1 не дает существенного улучшения качества водного 5 концентрата при значительных затратах хлороформа.

Двухкратная обработка хлороформом водного концентрата не позволяет полностью освободиться от сопутствующих ве- 0 ществ, а проведение четырехкратной обработки излишне; наиболее оптимальным является проведение трехкратной обработки.

Данные зависимости выхода таннина 5 от кратности обработки и соотношения эти- лацетата к водному остатку приведены в табл. 5.

Установлено, что наиболее оптимальным временем высушивания этилацетатной 0 вытяжки безводным сернокислым натрием является 22-24 ч. При меньшем промежутке времени в этилацетатной вытяжке сохраняются следы влаги, и конечный продукт не осаждается при обработке петролейным 5 эфиром или гексаном, более продолжительное высушивание этилацетатной вытяжки сернокислым натрием излишне.

Выявлено, что концентрирование этилацетатной вытяжки лучше проводить при 38-40°С, так как более высокая температура

приводит к изменению конечного продукта, а при более низких температурах затягивается время перегонки, что также приводит к нежелательным изменениям продукта (гидролизу).

Данные о зависимости полноты осаждения таннина от соотношения этилацетатно- го концентрата и петролейного эфира (гексана) приведены в табл.6.

Установлено, что оптимальными уело- виями высушивания конечного продукта является сушка его под вакуумом при 45-50°С в течение 5 ч, Более высокая температура приводит к разложению таннина, а проведение высушивания менее 5 ч недостаточно для полного высушивания,

Пример. Получение таннина.

1 кг воздушно-сухих листьев растения четырехкратно экстрагируют 70%-ным водным ацетоном противоточным способом (модуль 1:10) при 50°С. Полученные экстракты объединяют, ацетон отгоняют под вакуу- мом при 40°С. Водный концентрат обрабатывают в делительной воронке 3 раза хлороформом в объемном соотношении водный концентрат:хлороформ 3:1, затем водный концентрат обрабатывают 5 раз этилацетатом в том же соотношении. Этила- цетатные вытяжки объединяют, сушат свежепрокаленным сернокислым натрием (на 1 л вытяжки 200 г соли) в течение 22 ч. Затем этилацетатную вытяжку фильтруют, этила- цетат отгоняют под вакуумом при 38°С до помутнения раствора и появления светлого налета на стенках колбы и осаждаюттаннин в смеси с другими фенольными соединениями 4-кратным объемом гексана или петролейного эфира. Осадок отфильтровывают на воронке Бюхнера, промывают 500 мл гексана или петролейного эфира и высушивают в вакуум-сушильном шкафу при 45°С в течение 5 ч. Выход препарата (110 г) составляет 11% от веса сырья. Полученный препарат очищают от сопутствующих фенольных соединений с помощью колоночной хроматог- рафии на силикагеле. Выход очищенного таннина (62,0 г) составляет 56% от веса исходного препарата,

Полученный препарат таннина представляет собой аморфный порошок светло- кремового цвета, хорошо растворим в воде, спирте, метаноле, ацетоне, ДМСО, ДМФА, растворим в этилацетате, плохо растворим в диэтиловом эфире, не растворим в хлороформе, гексане, петролейном эфире. Rf 0,53 (ХБ Filtrak, система растворителей н.бута- нол - уксусная кислота - вода 40:12:28);

УФ-спектр (метанол, 0,01) 217,280 нм;

спектр ПМР снят на приборе Х-200 Varian с рабочей частотой 200 МГц: широкий бесструктурный синглет при 8,43 м.д. принадлежит протонам фенольных групп; ароматические протоны остатков галловой кислоты резонируют в области 6,9-7,7 м.д. в виде набора узких сигналов; при 6,36, 6,05, 5,68 и в области 4,25 - 4,70 м,д. с интегральным отношением 1:1:2:3 соответственно расположены сигналы протонов сахарного остатка D-глюкозы. Исходя из интегральной кривой, на один сахарный остаток приходится семь остатков галловой кислоты. Из низкопольного расположения сигналов протонов сахарного остатка следует, что все гидроксильные группы D-глюкозы замещены и, следовательно, в молекуле таннина присутствуют два дигалловых остатка, причем их место присоединения предпочтительнее в положениях 2 и 4 или 3 и 5.

Пример 2. Аналогичен примеру 1, но температура экстракции 53°С, температура концентрирования водно-ацетонового экстракта-43°С, время высушивания этилаце- татной вытяжки 23 ч, температура концентрирования этилацетатной вытяжки 39°С, температура высушивания таннина 48°С. Выход таннина 69,5 г.

Пример 3. Аналогичен примеру 1, но температура экстракции 55°С, температура концентрирования водно-ацетонового экстракта 45°С, время высушивания этилацетатной вытяжки 24 ч, температура концентрирования этилацетатной вытяжки 40°С, температура высушивания таннина 50°С. Выход таннина 78 г.

Пример 4. Определение интерферо- ниндуцирующей активности таннина сумаха (in vitro).

К монослоям клеток L-929, выращенным при 37°С на 96-луночных панелях под стандартным парциальным давлением С02 (5%), добавляли в различных концентрациях раствор таннина сумаха. После 3-часового контакта с препаратом клетки двухкратно обмывали раствором Хенкса и добавляли 100 мл питательной среды, содержащей 2% бычьей сыворотки.

Титры интерферона в культуральной жидкости определяли через 24 ч по подавлению цитопатического действия (ЦПД) текст-вируса (ЕМС) энцефаломиокардита мышей микрометодом на гомологичных культурах.

Данные представлены в табл. 7.

Специфичность интерферона подтверждали определением его термолабильности (прогревание в течение 30 мин при 56°С), кислотоустойчивости и чувствительности к обработке трипсином (0,2 мл 0,25%-кого раствора в течение 30 мин при 37°С).

П р и ме р 5. Определение интерферонин- дуцирующей активности таннина сумаха на белых беспородных мышах (in vivo).

Белым беспородным мышам (вес 10- 12 г) перорально и внутрибрюшинно вводили препарат в различных концентрациях. Для сравнения использовали препараты госсипола и мегосина. Титры интерферона определяли в сыворотке крови мышей через 48 ч после введения препарата. Данные приведены в табл. 8.

Таким образом, предлагаемый способ дает возможность получения таннина сумаха с высокой интерферониндуцирующей ативностью при значительно меньшей по сравнению с госсиполом и мегосином токсичностью in vivo и in vitro. Кроме того, таннин сумаха в отличие от госсипола и мегосина хорошо растворим в воде, что позво- ляет вводит его животным как парентерально, так и перорально.

Формула изобретения

Способ получения таннина листьев сумаха, обладающего интерферониндицирующей активностью, отличающийся тем, ч го, с. целью повышения активности и снижения токсичности и придания водорастворимых свойств, листья сумаха вида Rhus

glabra; Phus typhina или Rhus coriaria экстрагируют 70%-ным водным раствором ацентона при 50-55°С, экстракт концентрируют, водный концентрат обрабатывают трехкратно хролоформом в объемном соотношении хлороформ: водный концентрат 1:3, затем пятикратно этилацетатом в объемном соотношении этилацетат: водный концентрат 1:3, высушивают этилацетатную вытяжку безводным сернокислым натрием в течение 22-24 ч, концентрируют под вакуумом при 38--40°С, осаждают гексаном или петролейным эфиром при объемном соотношении экстракт:гексан или петролейный осЬио

, высушивают под вакуумом при 4Б- 50°С в течение 5 ч и очищают целевой продукт с помощью колоночной хроматографии на силикагеле.

Т а О л и ц а 1

Изобретение касается производных са- харов, в частности получения таннина листьевсумаха,обладающего интерферониндуцирующей активностью. Цель - повышение активности и снижение токсичности целевого продукта с приданием ему водорастворимых свойств. Процесс ведут экстракцией листьев сумаха вида Rhus glabra, Phus typhina или Phus coriarla 70%-ным водным раствором ацетона при 50-55°С с последующим концентрированием экстракта 3-кратной обработкой концентрата сначала хлороформом, взятым в 3-кратном объемном избытке, затем пятикратно этилацетатом, взятым в 3-кратном избытке, высушиванием безводным Na2S04

Таблица 3

Количество погибших клеток.

Продолжение табл.3

Таблица 4

Таблица 5

Таблица 6

Таблица 7

П р и м е ч а н и е. На каждую точку брали по 5 мышей.

Продолжение табл.7

Таблица 8