Питательная среда для перевиваемых клеток млекопитающих Советский патент 1992 года по МПК C12N5/00 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к составу сред, используемых для клеточных культур.

Целью изобретения является упрощение состава среды. ,

Способ получения предлагаемой питательной среды заключается в том, что пред- варительно готовят ферментативный гидролизат казеина путем обработки исходного материала ферментным препаратом в специально подобранных условиях, отделения взвешенных частиц и осветления полученной жидкости активированным углем.

После получения ферментативного гид- ролизата казеина вдеионизированной воде последовательно растворяют все необходимые компоненты и доводят рН среды до 6,9 продувкой углекислым газом. Питательную среду подвергают стерилизующей фильтрации через мембранный фильтр.

Пример 1. Технический кислотный казеин 1-го сорта (ГОСТ 17626-72) помещают в количестве 100 г в коническую колбу вместимостью 2 л, заливают 2 л дистиллированной воды и выдерживают при комнатной

температуре в течение 3 ч. Затем меняют воду на свежую, подогретую до 40°С, добавляют 20 г бикарбоната натрия и перемешивают до получения однородной суспензии. Доводят рН до 8,0. Гидролиз проводят панкреатином для производства сывороток (МРТУ 42 № 5046-65), который помещают в колбы емкостью 250 мл по 0.5 г. Потом в колбы разливают по 100 мл суспензии казеина и проводят гидролиз на термостатируе- мой качалке в течение 2 ч при 40°С. Гидролиз прекращают прогреванием колб в водяной бане при 75°С в течение 10 мин. Отделение взвешенных частиц проводят центрифугированием при ЮОООд в течение 15 мин, Затем осветляют гидролизат активным углем марки ОУ-А в течение 30 мин, используя 30 г сорбента на 1 л гидролизата. По окончании сорбции гидролизат казеина последовательно фильтруют через картон и мембранный фильтр.

Возможно применение ферментного препарата типа протосубтилина И ОХ.

Готовят питательную среду на деиони- зированной воде, последовательно раствосл

ч со сл

СА

о

ряют соли, глюкозу, аминокислоты, ферментативный гидролизат казеина, витамины, фенолрот. Затем доводят рН среды до 6,9 продувкой углекислым газом, после чего добавляют 10%-ный раствор поливинилпир- ролидона из расчета 20 мл на 1 л питательной среды, а также сыворотку крови крупного рогатого скота, антибиотик.

Питательную среду фильтруют через мембранные фильтры с размером пор 0,45 мкм и 0,22 мкм при избыточном давлении 0,5-1,0 эти. Готовая питательная среда должна храниться при4-6°С. Клетки ВНК-21 (С-13) суспензионно культивируют в конических колбах емкостью 250 мл при объеме заполнения 70 мл под резиновыми пробками на термостатируемой качалке (180 об/мин, амплитуда 20 мм) при 35± ±0,5°С. Продолжительность каждого пассажа равна 72 ч. всего проведено 29 пассажей. Начальная концентрация клеток в пассажах составила (0,4±0,1)-109 кл/л, средняя конечная концентрация клеток равна (2,4±0.1) 109 кл/л, количество жизнеспособных клеток в пассажах на уровне 99%. Пропись питательной среды НаименованиеКонцентрация

компонентов

L-аргинин0,115

L-глутамин0.584

L-триптофан0,015

L-цистин0,042

Холинхлорид0,050

Фолиевая кислота0,003

Никотинамид0,003

Пиридоксаль HCI0.003

Тиамин HCI0,003

Пантотенат кальция 0,003

Инозит0.006

Ферментативный

гидролизат казеина 3.0

Высокомолекулярный

поливинилпирролидон 2,0

Сыворотка крови

крупного рогатого скота 10,0

Глюкоза4,500

Хлористый кальций

()0,09

Хлористый калий (KCI) 0,36

Сернокислый семиводный магний

(МдЗСм -7Н20)0,18

Двухуглекислый натрий

(№НСОз)2.500

Хлористый натрий

(NaCI)5.880

Фосфорнокислый однозамещенный натрий

0,140 0,010 0,100

0

0

5

0

5

0

5

0

5

до 1 л.

(NaH2P04 -2Н20)

Феноловый красный

Сульфат канамицина

Деминерализованная

вода

Пример 2. Готовят питательную среду как описано в примере 1. Клетки ВНК-21 суспензионно культивируют в ферментере емкостью 5 л при объеме заполнения 3 л. Температура культивирования составляет 35,5±0,5°С. Скорость вращения мешалки 145±5 об/мин. Продолжительность каждого пассажа равна 72 ч, всего было проведено 6 последовательных пассажей. Начальная 5 концентрация клеток (0,4±0,1)- 109 кл/л, средняя конечная концентрация клеток (2,5±0,1)-10 кл/л, при этом в конце каждого пассажа количество жизнеспособных клеток в культуре составляет 98-99%.

Пример 3. а) Готовят питательную среду, как описано в примере 1. Однако ферментативный гидролизат казеина не вводят в ее состав. Клетки ВНК-21 культивируют суспензионным способом в колбах вместимостью 250 мл как описано в примере 1. Начальная концентрация клеток составляет (0.4±0.1)-10 кл/л конечная. концентрация - (0,4±0,1)-10 кл/л, т.е. в отсутствие ферментативного гидролизата казеина роста клеток не наблюдается.

б)Готовят питательную среду как описано в примере 1. Однако в ее состав не вводят псливинилпирролидон. Клетки ВНК-21 выращивают в суспензии как описано в примере 1, Начальная концентрация клеток составляет(0,4±0,1)-10 кл/л, клетки дегенерируют в течение первого пассажа, остаточное содержание клеток (0,07-0,08)-109 кл/л, в поле зрения были видны разрушенные клетки. Таким образом, в отсутствие пол- ивинилпирролидона роста клеток не наблюдается.

в)Готовят питательную среду как описано в примере 1. Однако содержание холин- хлорида не увеличивают до 50 мг/л, а сохраняют на уровне исходной среды. Клетки ВНК-21 культивируют в колбах как описано в примере 1. Начальная концентрация клеток (0,4±0,1)-109 кл/л, конечная - (0,4± ±0,1) 10 кл/л. Таким образом, при таком содержании холинхлорида рост клеток не осуществляется.

Формула изобретения Питательная среда для перевиваемых клеток млекопитающих, содержащая гидролизат белкового материала, аминокислоты, витамины, минеральные соли, глюкозу и сыворотку крупного рогатого скота, отличающаяся тем, что, с целью упрощения

состава среды, дополнительно вводят по- ливинилпирролидон, а в качестве гидроли- зата белкового материала используют ферментативный гидролизат казеина, при следующем соотношении компонентов, г/л: L-аргинин0,115

L-глутамин0,584

L-триптофан0,015

L-цистин0,042

Холинхлорид0,050

Фолиевая кислота0,003

Никотинамид0,003

Пиридоксаль HCI0,003

Тиамин HCI0,003

Пантотенат кальция 0,003 Инозит0,006

Ферментативный гидролизат казеина 3,0 Высокомолекулярный поливинилпирролидон 2.0

Сыворотка крови крупного

рогатого скота10,0

Глюкоза4,500

Хлористый кальций (CaCl2)0,090

Хлористый калий (KCI) 0,360

Сернокислый семиводный магний

(MgS04 -7H20)0,180

Двухуглекислый натрий

(№НСОз)2,500

Хлористый натрий

(NaCI)5,880

Фосфорнокислый одно- замещенный натрий

(№Н2РСм 2Н20)0,140

Феноловый красный 0,010

Сульфат канамицина 0.1

Деминерализованная вода .до 1 л.

Использование: биотехнология, состав сред, используемых для культивирования клеток животных. Сущность изобретения: в питательную среду для культивирования клеток животной ткани, содержащую гидролизат белковогосырья, аминокислоты, витамины, минеральные соли, глюкозу и сыворотку крупного рогатого скота, дополнительно вводят поливинил- пирролидон, содержание холинхлорида увеличивают, а в качестве гидролизата белкового материала используют ферментативный гидролизат казеина.