ШТАММ МИКРОМИЦЕТА TUCHODERMA VIRIDE PERS EX S.F. GRAY ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА ПРОТИВ ВОЗБУДИТЕЛЯ СЕРОЙ ГНИЛИ ВИНОГРАДА Российский патент 1994 года по МПК A01N63/04 C12N1/14 C12N1/14 C12R1/885 

Изобретение относится к сельскому хозяйству и представляет собой новый штамм, который может быть использован при хранении винограда в качестве источника биологической защиты.

Для биологической защиты успешнее всего применяются представители рода Тrichoderma. Эффективность использования грибов данного рода подтверждена многолетней практикой в борьбе с почвенными грибами (см. С. Dennis and J. Webster, 1971, Trans. Br. mycol. Soc. 57, (3), 363-369; Elad et al. , 1982, Can. J. Microbiol. , 28, 719-725; M. N. Schroth and J. G. Hancock, 1981, Ann. Rev. Microbiology, 35, 459-463; Elad J. , Barel R. , Chet I. , 1984, Soil Biol. and Biochem. , 16, 4, 381-386).

В качестве грибов-антагонистов чаще других используются виды Тrichoderma harzifnum и виды Т. viride. Естественное местообитание этих грибов - почва, где они чаще всего встречаются в подстилке. Это активные целлюлозоразрушители, участвующие в процессах деструкции растительного опада. Известна антагонистическая активность видов Тrichoderma против несовершенных грибов рода Aspergillus - A. candidus, A. luchuensis, A. niger, A. fumigatus, A. terreus (Rai B. , Singh V. N. , Singh D. - Plant and Soil, 1980, 57, N 1, p. 131-135); рода Fusarium: F. oxysporum, F. solani, F. graminearum, F. culmorum; Alternaria spp. , Botrytis cinerea, Collectotrichum Lindemuthianum; аскомицетов (Сhaetomium spp. , Coniochaeta); базидиальных (Lentinus edodes) (Бадяй С. Б. Защита растений, Вып. 9, с. 75-78; Beratlief Z. , Morched S. - Bull. Acad. Sci. agr. et forest. , 1983, N 12; Champion L. , Mitchel Sci. , Soc. , 1978, 94, N 2, р. 70; Knetmal M. B. , Hasabnis S. N. , Sardephpande T. S. , Diwakar M. P. - Curr. Sci. (India), 1984, 53, N 16, р. 862-868; Lacicova B. , Pieta D. - Ochr. rosl. , 1985, 29, N 5, p. 3-5; Tokimoto K. , Repts Tottori Mycol. Inst. , 1984, N 22, р. 63-64; Venkatasubbaian P. , Safuula K. M. - Pros. Indian Nat. Sci. Acad. , 1984, B 50, N 5, p. 525-529).

Известно практическое использование гиперпаразитов и антагонистов против широкого круга грибов - возбудителей вегетирующих растений, а также послеубoрочных гнилей плодов, овощей и винограда при хранении.

В частности, к снижению количества серой гнили на ягодах земляники после уборки урожая привело применение Тrichoderma viride в поле (Тronsmo A. , Dennis C. - Neth. J. Plant Pathol. , 1977, v. 83, Suppl. 1, p. 449-455).

Использование суспензий конидий Тrichoderma harzianum для обработки яблоневых деревьев в период цветения привело к уменьшению количества гнили, вызванной В. cinerea на яблоках (Тronsmo A. , Ystaas J. - Plant Dis. , 1980, v. 64, р. 1009).

Оценена антагонистические свойства 9 видов рода Тrichoderma в отношении В. cinerea. Обнаружена высокая антагонистическая активность у группы штаммов Тrichoderma, в которую входили виды Т. viride, T. harzianum, T. koningii, T. longibrachiatum (Sailloux, Froidefond-Bull. OEPP, 1987, v. 17, N 4, p. 541-547).

Известна защита винограда от серой гнили с помощью Тrichoderma viride и Т. harzianum с целью улучшения качества урожая (Dubos B. , Ulit J. , Bugaret Y. , Verdu D. - L'academie d'agriculture de France, 1978, 64, N 14, p. 1159-1167; Dubos B. - Pros. Int. Cont. Integr. Plant Prot. , Budapest, 1983, p. 41-47; Dubos B. in: Current perspectives in microbial ecology. Wachington, 1984, p. 370-373; Dubos B. , Bulit J. , - Microbial ecology of the phylloplanr. London est, 1981, p. 353-367; Davet P. - Bull. OEPP, 1987, 17, N 4, p. 535-540; Nair N. G. , Parker F. E. - Plant Pathol. , 1985, 34, N 2, p. 302-305).

Разработка биологического метода борьбы с патогенами винограда в условиях хранения имеет ряд трудностей. Антагонисты должны быть способны развиваться при низких температурах в хранилищах, сохраняться определенное время на поверхности ягод (Cook R. J. - Phytopathology, 1985, 75, N 1, p. 25-29; Wilson C= L. , Pusey P. L. - Plant Diseases, 1985, 69, N 5, р. 375-378).

Из известных штаммов грибов рода Тrichoderma, используемых как средство биологической борьбы против патогенных грибов, являются штаммы Тrichoderma harzianum Rifai Т-315 (АТСС N 20671) и Trichoderma harzianum Rifai Т-35 (АТСС N 20681), описанные в европатенте N 01333878.

Данные штаммы используются против грибов из родов Рyrhium, Rhizoctonia, Sclerotium, Fusarium для борьбы с такими заболеваниями, как черная ножка, корневая гниль, пелликуляриоз и шейковая гниль рассадных культур.

Однако виды или штаммы Тrichoderma могут быть по-разному антагонистичны к разным видам грибов (Н. D. Wells et al. , 1972, Phytopathology, 62, р. 442-447).

В дополнение к таким различиям в антагонизме было обнаружено, что внешние условия, в которых происходит взаимодействие, также влияют на степень биологической борьбы.

Заявляемый штамм Тrichoderma viride Pers. ex S. F. Gray 75 ВКМ F - 3271 D предлагается как средство биологической борьбы с патогенами винограда в условиях хранения, в частности к Botrytis cinerea.

В качестве прототипа взят стандартный препарат Триходерммин, представленный в [2] . Его эффективность проявляется при использовании на ягодных культурах в период цветения при борьбе с серой гнилью.

Недостатком известного препарата является то, что он недостаточно эффективно воздействует на серую гниль винограда.

Целью изобретения является выделение штамма триходермы, обладающего повышенной антагонистической активностью по отношению к возбудителю серой гнили винограда Botrytis cinerea и способностью сдерживать развитие патогена в период вегетации и хранения винограда, позволяющий уменьшить потери винограда от гниения путем уничтожения спор грибов на поверхности ягод перед их закладкой на хранение и подавления спороношения в процессе хранения.

Штамм Тrichoderma viride Pers. ex S. F. Gray ВКМ F - 3271 D выделен из гниющей древесины, поврежденной жуками-точильщиками. Номер штамма 75. Зрелая культура на агаровых косяках хранится в холодильнике при температуре -2. . . +3^оС с периодическими пересевами 2-3 раза в течение года.

Полученный штамм обладает следующими свойствами.

Макроморфология. Колонии на среде Чапека быстрорастущие, на 14-е сутки роста при температуре 22^оС достигают диаметра 6,5-7,0 см, мицелий рыхло-паутинистый, стелющийся, с темно-зелеными дерновинками спороношения. Обратная сторона колоний бесцветная. На сусло-агаре колонии в центре плоские, мицелий практически не заметен, периферическая часть колонии белая, пушистая. Воздушный мицелий хорошо развит, спороношение слабое.

Микроморфология. Конидии большей частью шаровилные, частично полушаровидные, с нежношиповатыми стенками 5,2х5,6х5,0-5,4 мкм.

Активность штамма.

Штамм N 75 является активным антагонистом по отношению к возбудителю серой гнили винограда Botrytis cinerea. Обладает способностью сдерживать развитие патогена в период вегетации и хранения винограда. Проявляет активность при 2^оС и в интервале 22-25^оС.

Способ определения активности штамма.

Лабораторные испытания проведены с использованием метода агаровых блоков (СЭГИ, 1983) при температурах 2^оС и 22-25^оС. Метод основан на способности растворимых метаболитов диффундировать в агаровую пластинку и в зависимости от интенсивности воздействия образовывать более или менее широкие зоны угнетения или стимулирования роста патогена (табл. 1).

В лабораторных условиях культуру Тrichoderma viride Pers. S. F. Gray 75 BKM F - 3271 D выращивают на косяках сусло-агара и среде Чапека в течение 12-14 сут при 22-25^оС, которую в дальнейшем используют в качестве посевного материала.

Пример получения препарата с помощью гриба Trichoderma viride Pers. S. F. Gray BKM F - 3271 D.

Для приготовления водной суспензии препарата в пробирку с маточной культурой штамма N 75 наливают 10 мл стерильной дистиллированной воды, затем микробиологической иглой осуществляют смыв спороносящего слоя с поверхностью питательной среды; пробирку тщательно встряхивают. Предварительно подготавливают пластиковые кюветы размером 0,31х0,25 м, залитые стерильной питательной средой - сусло-агар (из расчета 0,5 л среды на одну кювету) и накрывают их плотно прилегающим простерилизованным стеклом. Водную суспензию маточной культуры вносят в кюветы (из расчета 20 мл суспензии на кювету) и стерильным стеклянным шпателем растирают по всей поверхности питательной среды.

Культуру штамма N 75 выращивают при комнатной температуре в течение 12-14 сут. По истечении этого срока проводят смыв; кюветы освобождают от стекол и заливают небольшим количеством стерильной дистиллированной воды; затем стерильным шпателем тщательно смывают выросшую культуру с поверхности питательной среды. Водную суспензию гриба фильтруют через двойной слой стерильной марли. В полученном маточном растворе препарата определяют титр спор. Подсчет проводят в камере Горяева. Готовый продукт представляет собой жидкость темно-зеленого цвета.

Полевые испытания проводили в Молдове на винограде сортов Молдова, Мускат гамбургский и Италия.

П р и м е р. Столовые сорта винограда (Молдова, Мускат гамбургский, Италия) в период цветения и за 3-10 сут до уборки опрыскивают водной суспензией штамма гриба Тrichoderma viride Pers. ex S. F. Gray 75 BKM F - 3271 D в концентрации 108 спор/мл, при расходе раствора 1000 л/га.

Результаты испытания приведены в табл. 2 и 3.

Данные табл. 2 и 3 свидетельствуют о том, что обработка винограда водной суспензией штамма Тrichoderma viride Pers. ex S. F. Gray 75 BKM F - D позволяет снизить потери от гниения во время хранения на 10-12% и повысить выход пригодного для хранения винограда на 11-15% в зависимости от сорта.

Использование штамма микромицета (N 75) Тrichoderma viride Pers. S. F. Gray BKM Gray BKM F - 3271 D в качестве биологического препарата для борьбы с Botrytis cinerea снижает количество химических обработок винограда, а также уменьшает их вредное побочное действие. Достоинство применения данного штамма в том, что он оказывает также ингибирующее воздействие на следующие виды патогенов: Penicillium expansum, P. verrucosum var. cyclopium и не образуется устойчивых штаммов Вotrytis, как это происходит при применении фунгицидов.

Использование: сельское хозяйство, получение средств защиты винограда при хранении от серой гнили и касается нового штамма для получения этого средства. Сущность изобретения: штамм Trichoderma viride Pers. ex. S. F. Gray 75 выделен из гниющей древесины, поврежденной жуками-точильщиками. Депонирован во Всесоюзной коллекции микроорганизмов под N F - 3271Д. Штамм выращивают на сусло-агаре при комнатной температуре в течение 12 - 14 сут, затем споры смывают с поверхности среды, фильтруют, получают жидкость темно-зеленого цвета, которую используют для защиты винограда от серой гнили в концентрации 10⁸спор/мл. при расходе 1000 л/га. 3 табл.

Штамм микромицета Trichoderma viride Pers. ex S. F. Gray ВКМ F-3271Д для получения препарата против возбудителя серой гнили винограда.