ШТАММ МИКРОМИЦЕТА TRICHODERMA HARZIANUM RIFAI ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА ПРОТИВ ВОЗБУДИТЕЛЯ СЕРОЙ ГНИЛИ ВИНОГРАДА Российский патент 1994 года по МПК A01N63/04 C12N1/14 C12N1/14 C12R1/885 

Изобретение относится к сельскому хозяйству и представляет собой новый штамм, который может быть использован при хранении винограда в качестве источника биологической защиты.

Для биологической защиты успешнее всего применяются представители рода Trichoderma. Эффективность использования грибов данного рода подтверждена многолетней практикой в борьбе с почвенными грибами (см. С. Dennis and J. Webster, 1971, trans. Br. mycol. Soc. 57 (3), 363-369; Elad et al, 1982, Can. J. Microbiol. , 28, 719-725; M. N. Schroth and J. G. Hancock, 1981, Ann. Rev. Microbiology, 35, 459-463; Elad J. , Barek R. , Chet I. , 1984, Soil Biol. and Biochem, 16, 4, 381-386);
В качестве грибов-антагонистов чаще других используются виды Trichoderma harzianum и виды Т. viride. Естественное местообитание этих грибов - почва, где они чаще всего встречаются в подстилке. Это активные целлюлозоразрушители, участвующие в процессах деструкции растительного опада.

Известна антагонистическая активность видов Trichoderma против несовершенных грибов рода Aspergillus - A. candidus, A. luchuensis, A. niger, A. fumigatus, A. terreus (Rai B. , Singh V. N. , Singh D. - Plant and Soil, 1980, 57, N 1, p. 131-135); рода Fusarium: F. oxysporum, F. solani, F. graminearum, F. culmorum, Alternaria spp. , Botrytis cinerea, Collectotrichum Lindemuthianum, аксомицетов (Chaetomium spp. , Coniochaeta); базидиальных (Lentinus edodes) (Бадяй С. Б. , Защита растений, Вып. 9, - С. 75. . . 78; Beratlief Z. , Morched S. - Bull. Acad. Sci. agr. et forest, 1983, N 12; Champion L. , J. E. Mitchel SCi. , Soc. , 1978, 94, N 2, p. 70; Knetmal M. B. , Hasannis S. N. , Sardesphpande T. S. , Diwakar M. P. - Curr. Sci. (India), 1984, 53, N 16, p. 862-868; Lacicova B. , Pieta D. - Ochr. rosl. , 1985, 29, N 5, p. 3-5, Tikimoto K. , Repts Tottori Mycol. Inst. , 1984, N 22, p. 63-64; Venkatasubbaiun P. , Safuula K. M. - Pros. Indian Nat. Sci. Acfd. , 1984, B 50, N 5, p. 525-529).

Известно практическое использование гиперпаразитов и антагонистов против широкого круга грибов - возбудителей вегетатирующих растений, а также послеуборочных гнилей плодов, овощей и винограда при хранении.

В частности, к снижению количества серой гнили на ягодах земляники после уборки урожая привело применение Trichoderma viride в поле (Tronsmo A. , Dennis C. - Neth. J. Plant Pathol. , 1977, v. 83, Suppl. 1, p. 449-455).

Использование суспензий конидий Trichoderma harzianum для обработки яблоневых деревьев в период цветения привело к уменьшению количества гнили, вызванной В. cinerea на яблоках (Tronsmo A. , Ystaas J. , - Plant Dis. , 1980, v. 64, p. 1009).

Оценены антагонистические свойства 9 видов рода Trichoderma в отношении B. cinerea. Обнаружена высокая антагонистическая активность у группы штаммов Trichoderma, в которую входили виды T. viride, T. harzianum, T. koningii, T. longibrachiatum (Sailloux, Froidefond - Bull. OEPP, 1987, v. 17, N 4, p. 541-547).

Известна защита винограда от серой гнили с помощью Trichoderma viride T. haezianum с целью улучшения качества урожая (Dubos B. , Ulit J. , Bugaret Y. , Verdu D. - L'academie d'agriculture de France, 1978, 64, N 14, p. 1159-1167; Dubos B. - Proc. Int. Cont. Integr. Plant Prot. , Budapest, 1983. , p. 41-47; Dubos B. in. : Current perspectives in microbial ecology. Washington, 1984, p. 370-373; Dubos B. , Bulit J. - Microbial ecology of the phylloplane. London est, 1981, p. 353-367; Davet P. - Bull. OEPP, 1987, 17, N 14, p. 535-540; Nair N. G. , Parker F. E. - Plant Pathol. , 1985, 34, N 2, p. 302-305).

Разработка биологического метода борьбы с патогенами винограда в условиях хранения имеет ряд трудностей. Антагонисты должны быть способны развиваться при низких температурах в хранилищах, сохраняться определенное время на поверхности ягод (Cook R. J. -"Phytopathology", 1985, 75, N 1, p. 25-29; Wilson C. L. , Pusey P. L. - Plant Diseases, 1985, 69, N 5, 375-378).

Из известных штаммов грибов рода Trichoderma, используемых как средство биологической борьбы против патогенных грибов, являются штаммы Trichoderma harzianum Rifai T-315 (АТСС N 20671) Trichoderma harzianum Rifai T-35 (АТСС N 20681), описанные в европатенте N 01333878.

Данные штаммы используются против грибов рода Pythium, Rhizoctonia, Sclerotium, Fusarium для борьбы с такими заболеваниями, как черная ножка, корневая гниль, пелликуляриоз и шейковая гниль рассадных культур.

Однако виды или штаммы Trichoderma могут быть по-разному антагонистичны к разным видам грибов (H. D. Wells et al. , 1972, Phytopathology, 62, p. 442-447).

В дополнение к таким различиям в антагонизме было обнаружено, что внешние условия, в которых происходит взаимодействие, также влияют на степень биологической борьбы.

Заявленный штамм Trichoderma harzianum Rifai 86 BKM F-3272 D предлагается как средство биологической борьбы с патогенами винограда в условиях хранения, в частности к Botrytis cinerea.

В качестве прототипа взят стандартный препарат Триходермин. Его эффективность проявляется при использовании на ягодных культурах в период цветения при борьбе с серой гнилью.

Недостатком известного препарата является то, что он недостаточно эффективно воздействует на серую гниль винограда.

Целью изобретения является выделение штамма триходермы, обладающего повышенной антагонистической активностью по отношению к возбудителю серой гнили винограда Botrytis cinerea и способностью сдерживать развитие патогена в период вегетации и хранения винограда, позволяющей уменьшить потери винограда от гниения путем уничтожения спор грибов на поверхности ягод перед их закладкой на хранение и подавления спороношения в процессе хранения.

Штамм микромицета Trihoderma harzianum Rifai 86 BKM F-3272 D выделен при посеве водной суспензии смыва с поверхности ягод винограда сорта Мускат гамбургский на агаризованную среду Чапека, подкисленную молочной кислотой до рН 4-4,5. Отбор штамма проводили при последовательных и многократных посевах на указанную среду. Зрелая культура на агаровых косяках хранится в холодильнике при -2. . . +3^оС с периодическими пересевами 2-3 раза в течение года. Штамм хорошо растет и спороносит на средах Чапека и сусло-агаре при 22-25^оС.

Полученный штамм обладает следующими свойствами:
Макроморфология. Колонии на среде Чапека быстрорастущие, на 14-е сутки роста при 22^оС занимают всю поверхность чашки Петри, с белыми, желтыми, зелеными густыми дерновинками. Интенсивное темно-зеленое спороношение, обратная сторона колоний бесцветная. На сусло-агаре концентрические круги интенсивного зеленого спороношения.

Микроморфология. Конидии полушаровидные, часть конидий овальные, усеченным основанием, 4,5-5,0х4,2-4,4 мкм, с гладкими стенками.

Активность штамма. Штамм N 86 является активным антагонистом по отношению к возбудителю серой гнили винограда Botrytis cinerea. Обладает способностью удерживать развитие патогена в период вегетации и хранения винограда. Проявляет активность при 22-25^оС.

Способ определения активности штамма.

Лабораторные испытания проведены с использованием метода агаровых блоков (СЭГИ, 1983) при 2^оС и 22-25^оС.

Метод основан на способности растворимых метаболитов диффундировать в агаровую пластинку и в зависимости от интенсивности воздействия образовывать более или менее широкие зоны угнетения или стимулирования патогена.

В лабораторных условиях культуру Trichoderma harzianum Rifai BKM F-3272 D выращивают на косяках сусло-агара и среда Чапека в течение 12-14 сут при 22-25^оС, которую в дальнейшем используют в качестве посевного материала.

Пример получения препарата с помощью штамма гриба Trichoderma harzianum Rifai 86 BKM F-3272 D.

Для приготовления водной суспензии препарата в пробирку с маточной культурой штамма N 86 наливают 10 мл стерильной дистиллированной воды, затем микробиологической иглой осуществляют смыв спороносящего слоя с поверхности питательной среды; пробирку тщательно встряхивают. Предварительно подготавливают пластиковые кюветы размером 0,31х0,25 м, залитые стерильной питательной средой - сусло-агар (из расчета 0,5 л среды на одну кювету), и накрывают их плотно прилегающими простерилизованным стеклом. Водную суспензию маточной культуры вносят в кюветы (из расчета 20 мл суспензии на кювету) и стерильным стеклянным шпателем растирают по всей поверхности питательной среды.

Культуру штамма N 86 выращивают при комнатной температуре в течение 12-14 сут. По истечении этого срока проводят смыв; кюветы освобождают от стекол и заливают небольшим количеством стерильной дистиллированной воды; затем стерильным шпателем тщательно смывают выросшую культуру с поверхности питательной среды. Водную суспензию гриба фильтруют через двойной слой стерильной марли. В полученном маточном растворе препарата определяют титр спор. Подсчет проводят в камере Горяева. Готовый продукт представляет собой жидкость темно-зеленого цвета.

Полевые испытания проводили в Молдове на винограде сортов Молдова, Мускат гамбургский и Италия.

Пример конкретного выполнения. Столовые сорта винограда (Молдова, Мускат гамбургский, Италия) в период цветения и гриба Trichoderma harzianum Rifai 86 BKM F-3272 D в концентрации 10⁸ спор/мл при расходе раствора 1000 л/га.

Результаты испытания приведены в табл. 2 и 3.

Данные таблиц свидетельствуют о том, что обработка винограда водной суспензией штамма Trichoderma harzianum Rifai 86 BKM F-3272 D позволяет снизить потери от гниения во время хранения на 9-11% и повысить выход пригодного для хранения винограда на 9-12% в зависимости от сорта.

Использование штамма микромицета (N 86) Trichoderma harzianum, Rifai ВКМ F-3272 D в качестве биологического препарата для борьбы с Botrytis cinerea снижает количество химических обработок винограда, а также уменьшает их вредное побочное действие. Достоинство применения данного штамма в том, что он оказывает также ингибирующее воздействие на вид Penecillium expansum и не образуется устойчивых штаммов Botrytis как это происходит при применении фунгицидов. (56) Сельское хозяйство Молдавии, 1985, 7, 57 (прототип).

Использование: сельское хозяйство, производство средст защиты растений от возбудителей заболеваний растений и касается нового штамма для производства вышеуказанного средства. Сущность изобретения: штамм микромицета Frichoderma harztanum Rifai 86 выделен с поверхности ягод винограда. Депонирован в ВКМ под N F= 3272 Д. Препарат получают путем культивирования штамма на сусло-агаровой среде при комнатной температуре в течение 12-14 сут с последующим смывом спор. Готовят суспензию с титром 10⁸ спор/мл. Полученную суспензию используют для обработки винограда в период цветения. Штамм проявляет антагонистические свойства против Botrytis cinerea, Penicillium expansum. 3 табл.

Штамм микромицета Trichoderma harzianum Rifai ВКМ F - 3270 Д для получения препарата против возбудителя серой гнили винограда.