Способ культивирования неспорообразующих бактерий Советский патент 1992 года по МПК C12N1/00 C12N1/38 

Изобретение бтносится к микробиологии, в частности к биотехнологии культивирования неспорообразующих микроорганизмов, и может быть использовано в микробиологической и медицинской промышленности.

Внедрение биотехнологии в производство биологически активных веществ требует оптимизации развития бактериальных популяций и максимального использования культуральных сред0 Ий- тенсификация процессов культивирования может быть достигнута за счет уменьшения эффекта ингибирования роста клеток продуктами метаболизма.

Известно, что развитие микроорганизмов в культуральной жидкости прекращается задолго до полного исчерпания субстрата вследствие накопления промежуточных продуктов метаболизма, иигибирующих их рост,В результате в

0

С

каждом цикле ферментации теряется до 50% и более исходного органического субстрата.Кроме того, сброс отработанной культуральной жидкости, содержащей продукты метаболизма, способствует нарушению экологического баланса микрофлоры окружающей среды.

Известен диализный способ удаления продуктов метаболизма, ингибиторов роста из культивируемого объема. Способ позволяет продлить активное размножение клеток в экспоненциальной фазе, в результате чего достигается более высокая плотность популяции.

Однако повышение выхода биомассы с единицы культивируемого объема требует большого расхода культуральной гид- кости. Вследствие этого увеличение количества биомассы отрицательно сказывается на суммарном количестве использованной культуральной среды.

со оо

00 Јь

10

20

ду сложности осуществления в промышленности способ практического применения не находит.

Наиболее близким к предлагаемому является способ выращивания неспоро- образующих бактерий, предусматривающий инокуляцию микроорганизмов в жидкой питательной среде с внесенным в нее высокодисперсным кремнеземом, содержащим на поверхности ОН-группы, в концентрации 0,1-1,0 мг/мл. В результате выход биомассы бактерий повышается на 20-711%.

Недостатком известного способа яв- jj ляется малый прирост биомассы по сравнению с контролем.

Цель изобретения - повышение выхода биомассы за счет оптимального использования ресурсов питательной среды.

Поставленная цель достигается тем, что выращивание клеток микроорганизмов осуществляют в жидкой питательной среде в присутствии шариков из активной окиси алюминия в J-модификации с удельной площадью поверхности - 312 м /г в соотношеичи 50:1, которые помещают в перфорированную емкость,выполненную из химически инертного материала, и располагают в потоке аэрирующего газа.

Активная окись алюминия в У-модифи- кации, обладая амфотерными свойствами и развитой поверхностью, при нейтральных значениях рН способна выполнять функцию буферной среды и обеспечить удаление всех кислых продуктов метаболизма, ингибирующих рост микроорганизмов. Отсутствие неконтролируемых примесей, неизбежно присутствующих в сорбентах природного происхождения, позволяет проводить процесс культивирования без изменения отработанных режимов ферментации.

вий аэрации и перемешивания в рабочем (объеме ферментера, обеспечивая мас- |соперенос между сорбентом и культу- ральной жидкостью. При соотношении более 50:1 происходит неполное удаление продуктов метаболизма микроорганизмов за счет недостатка сорбцион- ных центров сорбента. При соотношении менее 50:1 вносится избыточное количество сорбента, требующее повышения интенсивности аэрации и активного перемешивания, что приводит к механическому измельчению сорбента

Способ осуществляют следующим образом.

В ферментер заливают питательную среду и в перфорированную емкость из химически инертного материала помещают сорбент. Затем устанавливают режимы термостатирования, аэрации и перемешивания и вносят посевную дозу клеток. Культивирование микроорганизмов проводят в течение 6-7 м, контролируя оптическую плотность культуральной жидкости и определяя число жизнеспособных клеток.

Пример 1. В ферментер объемом 1 л помещают 800 мл глюкозы - мине- У. ральной среды М 9, вносят ииокулят I клеток E.coli штамм К-12 в посевной дозе 1:tOO. Культивирование проводят при в течение 6-7 ч.

Перемешивание и аэрацию осуществляют с помощью мешалки и путем подачи 35 стерилоного воздуха с интенсивностью, необходимой для поддержания нормального роста клеток микроорганизмов. Число жизнеспособных клеток составляет (2,9±0,М-10эмл

Определение динамики роста числа жизнеспособных клеток проводят путем отбора проб через 30 мин с их последовательным разведением и высевом на поверхность агаризованной питательной

25

40

Экспериментальные данные по культи- 5 среды п°Дсч ет выросших колоний проводят через 1о ч после инкубирования

вированию клеток E.coli на минималь- .ной среде с добавлением различных образцов у-окиси алюминия, отличающихся площадью поглощающей поверхности Sua, показывают, что при использовании сорбентов с Sya, уравной 1)0 и 312 , концентрация жизнеспособных клеток повышается в 5 и 17 раз соответственно по сравнению с контролем.

Соотношение среда:сорбент 50:1 обеспечивает сорбцию продуктов метаболизма и при этом не изменяет услопри .

50

55

П р и м е р 2, Культивирование клеток E.coli проводят, как в примере 1, кроме того, что в ферментер помещают перфорированную емкость из химически инертного материала, заполненную У-окисью алюминия в форме шариков с Бэд Равной . Соотношение объемов сорбента и суспензии 1:50. Аэрацию осуществляют путем подачи воздуха через сорбент. Число жизнеспо

0

j

вий аэрации и перемешивания в рабочем (объеме ферментера, обеспечивая мас- |соперенос между сорбентом и культу- ральной жидкостью. При соотношении более 50:1 происходит неполное удаление продуктов метаболизма микроорганизмов за счет недостатка сорбцион- ных центров сорбента. При соотношении менее 50:1 вносится избыточное количество сорбента, требующее повышения интенсивности аэрации и активного перемешивания, что приводит к механическому измельчению сорбента

Способ осуществляют следующим образом.

В ферментер заливают питательную среду и в перфорированную емкость из химически инертного материала помещают сорбент. Затем устанавливают режимы термостатирования, аэрации и перемешивания и вносят посевную дозу клеток. Культивирование микроорганизмов проводят в течение 6-7 м, контролируя оптическую плотность культуральной жидкости и определяя число жизнеспособных клеток.

Пример 1. В ферментер объемом 1 л помещают 800 мл глюкозы - мине- . ральной среды М 9, вносят ииокулят I клеток E.coli штамм К-12 в посевной дозе 1:tOO. Культивирование проводят при в течение 6-7 ч.

Перемешивание и аэрацию осуществляют с помощью мешалки и путем подачи 5 стерилоного воздуха с интенсивностью, необходимой для поддержания нормального роста клеток микроорганизмов. Число жизнеспособных клеток составляет (2,9±0,М-10эмл

Определение динамики роста числа жизнеспособных клеток проводят путем отбора проб через 30 мин с их последовательным разведением и высевом на поверхность агаризованной питательной

5

0

при .

П р и м е р 2, Культивирование клеток E.coli проводят, как в примере 1, кроме того, что в ферментер помещают перфорированную емкость из химически инертного материала, заполненную У-окисью алюминия в форме шариков с Бэд Равной . Соотношение объемов сорбента и суспензии 1:50. Аэрацию осуществляют путем подачи воздуха через сорбент. Число жизнеспособных клеток составляет (1,6+0,1) Х10 мл

I Примерз. Культивирование кле- ток проводя-т, как в примере 2, но

равной

173

J)} 312 мг/г. Число жизнеспособных клеток

мл

г1

используют сорбент с S

знесг составляет (5,1±Р,9)-1010

П р и м е р 4, Культивирование проводят подобно примеру 3, но при соотношении объемов сорбента и суспензии 1:20 и для поддержания частиц сорбента во взвешенном состоянии увеличивают интенсивность аэрации и перемешивания культуральной суспензии. Это приводит к нарушению оптимума аэрации, измельчению сорбента и появлению мутности суспензии уже через 2 ч после начала культивирования и невозможности контроля за ростом клеток.

Примерз. Культивирование проводят подобно примеру 3 но при соотношении объемов сорбента и суспензии 1:60. Недостаток массы сорбента не обеспечивает полного удаления продуктов метаболизма. Число жизнеспособных клеток не выше, чем в примере 1.

П р и м е р 6. Культивирование проводят подобно примеру 3, но сорбент помещают непосредственно в ферментер.

8847

При перемешивании сорбента происходит механическое измельчение сорбента, ввиду чего невозможен спектрофотомет- . рический контроль за ростом клеточной популяции.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет оптимально использовать ресурсы питательной среды, повысить вы- jg ход биомассы в 5-17 раз и обеспечить полное удаление кислых продуктов метаболизма Сахаров, ингибирукхцих рост клеток,

15 Формула изобрете н-и я

Способ культивирования неспорообра- зующих бактерий в жидкой питательной среде в присутствии твердой фазы в

20 условиях аэрации, огличающий- с я тем, что, с целью увеличения выхода, в качестве твердой фазы используют шарики из активной окиси алюминия в у-модификации с удельной площадью

25 поверхности 140-312 ма/г в соотношении 50:1, помещенные в перфорированную емкость, выполненную из химически инертного материала, и располагают их в потоке аэрирующего газа.