Способ получения L-треонина Советский патент 1990 года по МПК C12P13/08 

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к способу получения незаменимой аминокислоты - L-треонина, применяемой в качестве компонента различных питательных смесей медицинского назначения, добавки в пищу человека и в корм животных, а также как реактив для фармацевтической и химической промышленности и как РОСТОВОЙ фактор для микроорганизмов, продуцирующих другие аминокислоты, например L-лизин, L-roносерин.

Известен способ получения Ь-треонина с использованием штамма Escherichia coli ВНИИгенетика 472 Т, способного усваивать сахарозу и устойчивого к треонину и гомосерину. Способ предусматривает при культивировании плазмидного продуцента выращивание посевного материала на жидкой посевной среде с последующим введением посевного материала в ферментационную среду. На стадии выращивания посевного материала в посевную среду вносят источники углерода, азота, минеральHbje соли, мел, а также гидролизат белоксодержащих субстратов и пеницил лин. После глубинной ферментации культ ральную жидкость обрабатывают и выде ляют целевой продукт. В известном способе при культивировании плазмидного продуцента треонина значение рН к концу выращивания посевного материала снижается до 5,0 5,5. При внесении посевного материал с низким значением рН в ферментацион ную среду, которая имеет нейтральное значение рН, происходит задержка начала разви-пм культуры на несколько часов, связанная с адаптацией культу ры к новым условиям культивирования, что приводит к увеличению продолжительности ферментащш. Максимальное накоппение L-треонина (до 32 г/л) достигается за 55 ч ферментации. При этом на синтез t г a вIHoкиcлoты расходуется 4г углеводов. Недостатками указанного метода получения L-треонина являются недостаточно высокий уровень накопления L-треонина и большая продолжитель-, ность ферментации. Целью предлагаемого изобретения является повышение уровня накопления треонина в кудьтуральной жидкости и сокран;ение продолжительности ферментации при одновременном уменьшении расхода углеводов на синтез аминокислоты. Поставленная цель достигается тем что в способе получения L-треонина, предусматривающем приготовление посевного материала путем выращивания продуцирукицих его микроорганизмов вида Escherichia coli в жидкой среде в присутствии гидролизата или автоли зата белоксодержащего субстрата и пенициллина, введение посевного мате риала в ферментационную среду, содер жащую источники углерода, азота и минеральные соли, ферментацию в глубинных условиях с последующей обработкой культуральной жидкости и вьще лением целевого продукта, предложено согласно изобретениюпри приготовлении посевногр материала из вида Escherichia coli использовать штамм Escherichia coli ВНИИгенетика 472 Т-23, выращивание которого осуществляют при рН 6,5-7,5 путем дробного введения в посевную среду аммиачной воды. Способ позволяет получить до 55 г/л L-треонина за 40 ч ферментации при минимальном расходе углеводов до 2,5 2,5 г на 1 г треонина. Штамм E.coli ВНИИгенетика 472 Т-23 депонирован в Центральном музее промьшшенных микроорганизмов и имеет регистрационньй номер ЦМПМ В-2307. Штамм E.coli ВНИИгенетика 472 Т-23 и штаммпрототип E.coli ВНИИгенетика 472 Т имеют общего предшественника - штамм E.coli ВНИИгенетика 472, который получен введением детерминантов и сбраживания сахарозы в клетки штамма E.coli ВНИИгенетика М-1, и являются мутанта ми этого штамма, устойчивыми к треонину и гомосерину при их содержании в среде более 0,5 г/л. Штамм E.coli ВНИИгенетика 472 Т-23 отличается от штамма E.coli ВНИИгенетика 472 Т стабильным сохранением признака устойчивости к указанным аминокислотам.и более стабильным сохранением плазмиды в процессе культивирования на обогащенных питательных средах, а также более высокой удельной продуктивностью (см. табл.1). Штамм E.coli ВНИИгенетика 472 Т-23 имеет следующую культурально-морфоло-. гическую характеристику. Морфолагия. Грамотрицательные слабоподвижные тонкие палочки с закругленными концами размером 1,5-2 мкм в длину. Культурально-физиологические признаки. Мясо-пептонный агар. Через 24 ч роста при 37 С образует круглые беловатые полупрозрачные колонии диаметром 1,5-3 мм, поверхность колонии гладкая, края ровные илислегка волнистые, центр колонии слегка припод- ция пастообразная, легко эмульгиру- ются. Рост на агаризованной минимальной среде Адамса. Через 40-48 ч роста при 37°С образует колонии 0,5-1,5 мм в диаметре, серовато-белые, полупрозрачные слегка с блестящей поверхностью, ослизняющиеся через 4-5 суток. Рост в мясо-пе-птонном бульоне. После 24 ч роста при 37°С наблюдается сильное«равномерное помутнение, небольшой осадок, запах характерный. Рост в жидкой минимальной среде Адамса. Через двое суток роста с аэрацией при наблюдается сильное

мере необходимости. На 27 часу ферментации концентрация треонина в культуральной жидкости достигает 48 г/л, на 40 часу - 55 г/л. Расход сахара на 1 г треонина на конец ферментации составляет 2,5 г.

Для выделения треонина 400 мл культуральной жидкости нагревают в течение 5 мин до температуры , затем биомассу отделяют центрифугированием. Полученный нативный раствор упаривают под вакуумдм до 80 мл, добавляют к нему 20 мл этанола и кристаллизуют при температуре . Кристашш фильтруют и сушат. Получают г L-треонина.

Пример 2. Продуцент треонина и условия выращивания посевного материала те же, что и в примере 1. Отли

чие состоит в том, что значение рН в ходе выравщвания посевного материала поддерживают на уровне 6,5. Через 24 ч культивирования посевной-материал с титром клеток 1-10 (доля клеток, утративших плазмиду, не более 6%) в количестве 10% вносят в ферментационнз среду следующего состава,%: Глюкоза2

Аммоний сернокислый 0,5 Калий фосфорнокисгалй однозамещенный 0,1 Ферментацию ведут в тех же условиях, что и в примере 1, с тем отличием, что в качестве рН-статирукнцего агента используют питательную добавку, состоящую из смеси 40% раствора глюкозы и 25% водного раствора аммиака в соотношении 6:1 (по объемам). Через 40 ч ферментации накопление треонина составляет 41 г/л. Расход глюкозы на t г синтезированного треонина составляет 3,1 г.

Для вьщеления L-треонина 400 мл культуральной жидкости нагревают в течение 20 мин до , затем биомассу отделяют центрифугированием. Полученный нативный раствор пропускают через колонку со смолой КУ-2-8 в форме. Сорбированный треонин элюируют 3%-ным раствором аммиака, упаривают до содержания сухих веществ 80%, добавляют зтанол в количестве 1/3 отобъема упаренного алюата и кристаллизуют в течение 12 ч при температуре О- (+5) С. Кристаллы L-треонина отфильтровывают, промьтают и.сушат. Получают 15 г L-треонина (выход составляет 92%). Анализ чистоты продукта методом тонкослойной хроматографии (10 мкг) показывает отсутствие других аминокислот.

П р и м е р 3. Продуцент треонина и условия выращивания посевного материала те же, что и в примере 1. Отличие состоит в том, что в качестве питательной добавки в посевную среду вместо автолизата дрожжей вносят гидролизат БВК в количестве (в расчете на исходный БВК). Посевной материал выращивают в условиях рНстатирования при рН 7,5iO,1 в течение 24 ч. Титр клеток в готовом по севном материале 0,9-10 кл/мл (доля, клеток, утративших плазмиду, не более 8%). Посевной материал в количестве 10% используют для засева ферментационной среды следующего состава, %г Сахароза8

Аммоний сернокислый 0,5 Калий фосфорнокислый однозамещенный 0,1 Ферментацию ведут в тех же условиях, что и в примере 1. Через 13 ч

культивирования, когда концентрация углевода в среде снижается до.5% в ферментационную среду вносят дополнительно еще 4% сахарозы. К 30 часам ферментации сахар утилизуется полностью и накопление треонина составляет 39 г/л. На синтез 1 г треонина расходуется 3,0 г сахарозы.

Для вьщеления L-треонина культуральную жидкость обрабатывают также, как в примере 1. Полученный нативный раствор упаривают до содержания сухих веществ 30% и кристаллизуют при охлаждении (+3-5°С). Получают технический препарат L-трёонина с содержанием основного вещества 90%. Выход продукта составляет 75%.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет снизить продолжительность ферментации до 30-40 ч по сравнению с 30-55 ч ito известному способу. При этом выход составляет 39-55 г/л Lтреонина (в известном способе максЬмальный выход, достигаемый за 55 ч ферментации, составляет 32 г/л). Минимальный расход углеводов на синтез 1 г L-треонина составляет 2,5 г, что на 40% ниже, чем в известном, в котором на синтез 1 г аминокислоты расходуется 4 г углеводов.

59

равномерное помутнение, запах характерный.

Рост по уКолу в мясо-пептонном агаре. Хороший рост по всему уколу.

Рост на желатине. Желатину не разжижает.

Рост на молоке. Хороший рост с коагуляцией молока.

Образование индола. Индол образует.

Рост на различных: углеводах. Хорошо растет на сахарозе, глюкозе, лактозе, маннозе, галактозе, ксилозе, фруктозе, глицероле, маннитоле с образовамием кислоты и газа.

Отношение к антибиотикам. Устойчив к пенициллину.

Патогенность. Не патогенен.

Соде1 жание плазмид. Клетки содержат многокопийную плазмиду pYN (мол.вес 5.8 мегадальтон), обеспечив ающую устойчивость бактерий к пени циллину и Н1есущую гены треонинового оперона.

Способ осуществляют следующим образом.

Клетки продуцента E.coli ВНИИгенетика 472-Т-23 выращивают на агаризованной шнимaльнoй питательной среде в присутствии пеницшшина, затем суспензией клеток, (;мытых со скошенного агара, засевают жидкую питательную посевную среду, содержащую источники углерода, азота, необходимые минерапьные соли, питательную добавку в виде гидролизатов белоксодержащих субстратов и пенициллин. Посевной материал выращивают в ферментере, оснащенном системой рН-статирования, при температуре 35-37 6 и непрерывном азрировании и перемешивании в течение 20-30 ч. Значение рН в ходе выращивания посевного материала поддерживают на уровне 6,5-7,5 дробным введением в ферментер аммиачной воды. Приготовленный таким образом посевной материал используют для засева ферментационной среды, содержащей источники углерода (например сахар или глюкозу) источники азота и необходимые минеральные сол. Ферментацию осуществляют в ферментерах, оснащенных системой рН-статирования, при рН 6,5-7,5, температуре 35-37С и непрерывном перемешивании и азрировании. В качестве рН-статирующего агента применяют либо аммиачную воду, либо сбаллансированную по углероду и аммиаку подпитку.

7 ,

Продолжительность ферментации 30-40 ч На 40 ч культивирования в культуральной жидкости накапливается до 55 г/л треонина. Для вьщеления треонина культуральную жидкость подвергают быстрому нагреву в течение не более 20 мин до температуры 60-100 С, с целью предупреждения лизиса клеток, затем биомассу отделяют центрифугированием или сепарированием. Выделение треонина из полученного нативного раствора осуществляют одним из известных способов.

Способ поясняется следующими примерами.

Пример 1. Культуру продуцента E.coli ВНИИгенетика 472 Т723, выращенную на агаризованной минимальной среде с глюкозой в присутствии пенициллина, пересевают на жидкую посевную питательную среду следующего состава , %:

Сахар технический 4 Аммойий сернокислый 0,5 Калий фосфорнокислый двузамещенный0,2

Магний сернокислый 0,04 Автолизат дрожжей 0,2 Пенициллин . 0,01 Доза засева 1-10 клеток в мл. Выращивание посевного материеша проводят в ферментере емкостью 0,5 л при аэрировании 0,5 л воздуха в минуту, перемешивании 900 об/мин, температуре 37С. рН-статирование осуществляют на уровне 7,01.0,1 путем автоматической подачи в ферментер аммиачной воды. Время выращивания посевного материала 20 ч. Титр клеток в готовом посевном материале l-lO Kn/Mn (доля клеток, утративших плазмиду, не более 6%)., Посевной материал в количестве 10% вносят в ферментационную среду следующего состава, %:

Сахар технический 8 Аммоний сернокислый 0,5 Калий фосфорнокислый однозамещенный 0,1 . Ферментацию проводят в ферментере с рабочим объемом 0,5 л, оборудованном системой рН-статирования. Режим ферментации: аэрирование 0,5 л/мин, перемешивание 900 об/мин, температура 37°С, рН-статирование на уровне 7,0t ±0,1 путем подачи аммиачной воды. После исчерпания из ферментахщонной среды начальной порции сахара его вносят дробно в несколько порций, по

Сравнительная характеристика штаммов E.coli ВНИИгенетика 472 Т и 472 Т-23

Относительное содержание клеток, сохраняющих после 10 генераций на бульоне Хоттингера, устойчивость,к

треонину и гомосерину, %

ВНИИгенетика 472 Т 1-3 ВНИИгенети.ка 472 Т-23 100

Максимальная удельная продуктивностьг треонина г биомассы в ч

пенициллину, %

0,14

82-98 0,23 98-99

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-ТРЕОНИНА, предусматривающий приготовление посевного материала путем выращивания продуцирующих его микроорганизмов вида Escherichia coli в жидкой среде в присутствии гидролизата или автолизата белоксодержащего субстрата и пенициллина, введение посевного материала в ферментативную среду, содержащую источники Углерода, азота и минеральные соли, ферментацию в глубинных условиях с последующей обработкой культуральной жидкости и выделение.м целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода треонина, снижения продолжительности ферментации при одновременном уменьшении расхода сырья, при приготовлении посевного материала из вида Escherichia coli используют штамм Escherichia coli ВНИИ генетика 472 Т-23, выращивание которого осуществляют при рН 6,5-7,5 путем дробного введения в посевную среду аммиачной воды.