Способ определения скорости окисления ортодианизидина в иммуноферментном анализе Советский патент 1988 года по МПК G01N33/53 

05

00

Изобретение относится к медицине, а именно к области иммунохимии и касается скорости определения окисле- :ния ортодианизидина в иммунофермент- ном анализе.

Цель изобретения - увеличение ста бильности результатов за счет одно- |временного увеличения скорости реак- |ции, стабилизации фермента и длитель |ного сохранения оптической прозрач- |ности оксидатов.

1Способ осуществляют следующим образом.

Пример 1„ В пробирку вносят

2мл раствора пероксидазы или ее конъюгата со строфантином К н 0,1 М фосфатном буфере с рН 6,0; 0,1 мл раствора ортодианизидина (о-ДА)

и 0,8 мл водного раствора сополимера 1 или 2, Реакцию начинают добавлением 0,1 мл раствора перекиси водорода. Исходные концентрации реагентов. в реакционной смеси объемом 3 мл равны: 0,31 нМ пероксидазы; 0,4 мМ р-ДА; 1,0 мМ перекиси водорода и iO,5 вес„% сополимера 1 , Сополимер по |Ливинилового спирта и акриловой кис- |лоты 10:1 или сополимера 2 (соот

35

40

1ошение 4:1, Реакцию проводят в сополимера 1 - блок-сополимер окисей

пропилена и этилена с числом звеньев 5 и 15 соответственно, или блок-сополимера 2 (число звеньев 10 и 33) или блок-сополимера 3 (число звеньев 15 и 50)о Реакцию начинают добавлением О,1 мл раствора перекиси водорода Исходные концентрации реагентов в реакционной смеси объемом 3 мл равны: 0,31 нМ пероксидазы; 0.,4 мМ о-ДА; 1,0 мМ перекиси водорода и 0,1 % блок-сополимеров о Реакцию проводят в термостатированной кювете спектрофотометра, регистрируя поглощение света на длине волны 460 нм, соответствующей максимуму поглощения продуктов окисления ортодианизидина.

П р и М е р 5о В 0,01 М фосфатный буфер с рН 7,5, содержащий 0,15 М NaCl, вносят пероксидазу i-ши конъюгат пероксидазы хрена с тремя молекулами строфантина К до конечной концент- ра ции 1,5 нМ и 0,5 вес.% блок-сополимера 1, Смесь выдерживают при 20 С разное время, отбирают аликвоты и определяют остаточную активность конъюгата при окислении о-ДА в О,1 М цит- ратно-ац татном буфере с рИ 6,0, содержащем 0,2 или 0,4 мМ ортодиаиизи остатированной кювете спектрофото- |метра, регистрируя поглощение света |на длине волны 460 нм, соответствую- ей максимуму поглощения продуктов окисления ортодианизидина. По опти- еской. плотности рассчитывают началь- рые скорости окисления о-ДА в М-с , спользуя коэффициент молярной экс- Тинкции продуктов его окисления, травный jOOOO M -см .

Пример-2. В О,01 М фосфатный буфер с рН 7,5, содержащий 0,15 М NaCl, вносят пероксидазу или конъюгат пероксидазь хрена с тремя молекулами строфантина К- до конечной концентрации 1 ,5 нМ и 0,5 вес.% сополимера 1. Смесь выдерживают при 20 С разное время, отбирают аликвоты и определяют остаточную ферментативную активность конъюгата при окислении о-ДА в 0,1 М фосфатном буфере с рН 6,0; содержащим 0,2 мМ ортодианизидина. Реакцию при 20°С начинают добавлением пербората натрия до конечной концентрации 1,0 мМ и ведут ее 1 мин, регистрируя оптическую плотность на длине волны 460 НМ,

ПримерЗ. В пробирку вносят 2 мл раствора пероксидазы или ее

45

50

55

Q

5

5

0

конъюгата со строфантином К в 0,02 М фосфатном буфере с рН 6,0; 0,1 мл раствора ортодианизидина, 0,8 мл раствора сополимера в том же буфере и добавляют О,1 мл раствора перекиси водорода Концентрации.реагентов в системе составляют: 0,15 нМ пероксидазы; 0,4 мМ о-ДА; 1,0 мМ HjO,; и 0,1% сополимера 1 , Во времени регистрируют светопропускание оксидата на длине волны 800 нм„

Проведение пероксидазного окисления в присутствии сополимеров 1 или 2 обеспечивает повышение скорости реакции в 2,2 - 2,45 раза, увеличение термостабильности конъюгата пероксидазы со строфантином в 2,7 раза и увеличение светопропускания оксидата в 4,5 раза, что делает возможным корректное определение начальных скоростей окислений ортодианизидина в течение длительного (более 3ч) времени.

Приме р4. В пробирку вносят 2 мл раствора пероксидазы или ее конъюгата со строфантином К в 0,02 М фосфатном буфере с рН 6,0; 0,1 мл раствора о-ДА и 0,8 мл раствора блокдина. Реакцию при 20°С Ha4HHah3T добавлением 1,0 мМ пербората натрия и ведут ее 1 мин, регистрируя оптическую плотность на длине волны 460 нм,

Прийерб. В пробирку вносят 2 мл раствора пероксидазы или ее конъюгата со строфантином К в 0,02 М фосфатном буфете с рН 6,0; 0,1 мл раствора ортодианизидина, 0,8 мл раствора блок-сополимера 2 в том же буфере и добавляют 0,1 мл раствора перекиси водорода.-Жонцентрации реагентов в системе составляют: 0,15 нМ

ции окисления о-ДА в 0,1 М фосфатном буфере с рН 6,0, содержащем 0,2 мМ о-ДА. Реакцию начинают добавлением пербората натрия до конечной концентрации 1,0 мМ и ведут ее 1 мин, регистрируя оптическую плотность на длине волны 460 нмо

Пример9о В пробирку вносят 2 мл раствора пероксидазы или ее конъюгата со строфантином К в 0,02 М фосфатном буфере с рН 6,0; 0,1 мл раствора о-ДА, 0,8 мл раствора АЭП в том же буфере и добавляют 0,1 мл

Изобретение относится к медицине, точнее - к иммунохимии, касается скорости определения окисления орто- дианизицина (о-ФА) в иммунофермент- ном анализе. Цель изобретения - увеличение стабильности результатов анализа за счет одновременного увеличения скорости реакции, стабилизации фермента и длительного сохранения оптической прозрачности оксидов Реакцию проводят в термостатированной кювете спектрофотометра, регистрируя поглощение света на длине волны 460 нм, соответствующей максимуму поглощения продуктов окисления о-ДА. По оптической плотности рассчитывают начальные скорости окисления о-ДА м с используя козффициент (Л молярной экстинции продуктов его окисления, равный 30000 ,

пероксидазы; 0,4 мМ О -ДА; 1,0 мМ HjOj 5 раствора перекиси водорода, Концент- и 0,1% блок-сополимера. Во времени регистрируют светопропускание окси- дата на длине волны 800 им.

Проведение пероксидазного окис- . ления в присутствии блок-сополимеров 20 окисей пропилена и этилена обеспечивает повышение скорости реакции в 1,33 раза, увеличение термостабильности конъюгата пероксидазы со строфантином в 2,88 раза и рост свето- 25 пропускания оксидата в 4,4 раза,что делает возможным корректное определение начальных скоростей окисления ортодианизидина в течение длительного (более 3 ч) времени.30

Пример7о В пробирку вносят 2 мл раствора пероксидазы или ее конъюгата со строфантином К в 0,02 М фосфатном буфере с рН в,0; 0,1 мл раствора о-ДА и 0,8 мл раствора АЭП - алкиловые эфиры полиэтиленгликоля, фракция сп 10-18ит 6-10в том же буфере, Реак цию начинают добавлением 0,1 мл раствора перекиси водорода. Исходные концентрации pea- 40 гентов в реакционной смеси общим объемом 3 мл равны: 0,31 нМ пероксидазы, 0,4 мМ о-ДА; 1,0 мМ перекиси водорода и 0,1 % АЭП, Реакцию проводят в термостатированной кювете 45 спектрофотометра, регистрируя поглощения света на длине волны 460 нм, соответствующей максимуму поглощения продуктов окисления ортодианизидина «50

Пример8, ВО,01М фосфатный буфер, содержащий 0,15 М NaCl, с рН 7,5 вносят пероксидазу или конъю- гат пероксидазы хрена с тремя моле35

рации реагентов в реакционной смеси объемом 3 мл равны: 0,15 нМ пероксидазы; 0,4 мМ о-ДА; 1,0 мМ перекиси водорода и 0,5% АЭП, Во времени регистрируют светопропускание оксида- тов на длине волны 800 нм.

Проведение пероксидазного окисления ортодианизидина в присутствии АЭП обеспечивает повышение скорости реакции в 1,7 раза, увеличение термостабильности конъюгата пероксидазы со строфантином в 2,75 раза и увеличение светопропускания оксидатов, что делает возможным корректное измерение начальных скоростей окисления ортодианизидина в течение длительного времени (более 3 ч). По совокупности своих полезных характеристик АЭП превосходит Твин 20 и Плюроник Л-64.

Пример 10, В пробирку вносят 2 мл раствора пероксидазы или ее конъюгата со строфантином К в 0,02 М фосфатном буфере с рН 6,0; 0,1 мл раствора о-ДА и 0,8 мл раствора ЧСА (алкилтриметиламмонийхло- рид с п 7 - 18 (ЧСА-1 ), с г. 7 - 9 (ЧСА-2) и с п 17-18 (ЧСА-3), а также алкилдиметилбензиламмоний с п 10- 18 (ЧСА-4) в том же буфере Реакцию начинают добавлением Oji мл раствора перекиси водорода. Исходные концентрации реагентов в реакционной смеси общим объемом 3 мл равны: 0,31 нМ пероксидазы; 0,4 мМ о-ДА; 1,0 мМ водорода и 0,5% ЧСА-1, Реакцию проводят в термостатированной кювете спектрофотометра, регистрируя поглощение света на длине волны

кулами строфантина К до конечной кон- gg 460 нм, соответствующей максимуму

центрации 1,5 нМ и 0,5 % АЭП Смесь вьщерживают при 20 С разное время, отбирают аликвоты и определяют остаточную активность конъюгата в реакпоглощения продуктов окисления орт дианизидина

Приме р П. В 0,0) М фосфат ный буфер с рН 7,5, содержащий

5 раствора перекиси водорода, Концент-

0 5 0

0 5 0

5

рации реагентов в реакционной смеси объемом 3 мл равны: 0,15 нМ пероксидазы; 0,4 мМ о-ДА; 1,0 мМ перекиси водорода и 0,5% АЭП, Во времени регистрируют светопропускание оксида- тов на длине волны 800 нм.

Проведение пероксидазного окисления ортодианизидина в присутствии АЭП обеспечивает повышение скорости реакции в 1,7 раза, увеличение термостабильности конъюгата пероксидазы со строфантином в 2,75 раза и увеличение светопропускания оксидатов, что делает возможным корректное измерение начальных скоростей окисления ортодианизидина в течение длительного времени (более 3 ч). По совокупности своих полезных характеристик АЭП превосходит Твин 20 и Плюроник Л-64.

Пример 10, В пробирку вносят 2 мл раствора пероксидазы или ее конъюгата со строфантином К в 0,02 М фосфатном буфере с рН 6,0; 0,1 мл раствора о-ДА и 0,8 мл раствора ЧСА (алкилтриметиламмонийхло- рид с п 7 - 18 (ЧСА-1 ), с г. 7 - 9 (ЧСА-2) и с п 17-18 (ЧСА-3), а также алкилдиметилбензиламмоний с п 10- 18 (ЧСА-4) в том же буфере Реакцию начинают добавлением Oji мл раствора перекиси водорода. Исходные концентрации реагентов в реакционной смеси общим объемом 3 мл равны: 0,31 нМ пероксидазы; 0,4 мМ о-ДА; 1,0 мМ водорода и 0,5% ЧСА-1, Реакцию проводят в термостатированной кювете спектрофотометра, регистрируя поглощение света на длине волны

460 нм, соответствующей максимуму

поглощения продуктов окисления ортодианизидина

Приме р П. В 0,0) М фосфатный буфер с рН 7,5, содержащий

0,15 М NaCl, вносят пероксидазу или | :онъюгат пероксидазы хрена с тремя йолекулами строфантина К, до конечной концентрации 1-,5 нМ и 0,5 вес.% ilCA-1. Смесь выдерживают при разное время, отбирают аликвоты и Определяют остаточную ферментативную Активность конъюгата при окислении |э-ДА в О, 1 М фосфатном буфере с рН 13,0, содержащим 0,2 мМ ортодианизи- дина. Реакцию начинают добавлением иербората натрия до конечной концент )ации 1,0 мМ и ведут ее I мин, регистрируя оптическую плотность на дли- ле волны 460 нм

Пример 12„ В пробирку вносят : мл раствора пероксидазы или ее 1сонъюгата со строфантином К в 0,02 М (зосфатном буфере с рН 6,0; 0,1 мл )аствора о-ДА, 0,8 мл раствора ЧСА-1 | том же буфере и добавляют 0,1 мл )аствора перекиси водорода. Концент- )ация реагентов в системе составляет 0,15 нМ пероксидазы; 0,4 мМ о-ДА;

,0 мМ перекиси водорода и 0,5% времени регистрируют светопропус- кание оксидата на длине волны 800 им В отсутствие; ЧСА-1 светопропускание падает очень быстро до 20% от на- рального уровня, в то время как в присутствии ЧСАт- светопропускание фксидата изменяется медленно до 92% фт начального уровня„ i Проведение пероксидазного окисле - ортодианизидина в присутствии Четвертичных солей аммония 1-4 обес- : ечивает повышение скорости реак- JmH в 2 раза, увеличение термоста- фильности конъюгата пероксидазы со Строфантином К в 2,86 раза и увели- ение светопропускания оксидатов в 4,6 раза,- что делает возможным кор- рекчиое измерение начальных скоростей окисления ортодианизидина в те- ение длительного времени (более 3 ч

Таким образом, все указанные ве- ВДества позволяют увеличить стабиль- Иссть результатов анализа за счет (Одновременного увеличения скорости реакцлм, стабилизации фермента и длительного сохранения оптической

прозрачности оксидатов. Используемые в прототипе детергенты : Твин-20, Плюроник 1 64,Тритон Х-100 таким комплексом полезных свойств не обладают, так как Твин-20 не .обнаружил стабилизирующего зффекта, Плюроник 1 64 практически не влияет на прозрачность реакционной смеси, а Тритон Х-100 сам эффективно окисляется пероксидазой хрена, что вызывает инициирование деструкции биокатализатора. Позтому их использование ограничено .

Формула изобретения

Способ определения скорости окисления ортодианизидина в иммунофер- ментном анализе nyteM инкубирования пероксидазы хрена или ее конъюгатов со строфантином К и перекиси водорода или пербората натрия в присутствии поверхностно-активных веществ, о т - ли чающийся тем, что, с

целью увеличения стабильности резуль- .татов анализа за счет одновременного увеличения скорости реакции, стабилизации фермента и длительного сохра- нения оптической прозрачности оксидатов, в качестве поверхностно-активного вещества используют привитой сополимер поливинилового спирта и акриловой кислоты с соотношением компонентов (4-10):1, или блок-сополимеры окисей пропилена и этилена с длиной алкильного радикала С$- числом- звеньев 5 - 15 и 1 5 - 50 для окисей пропилена и этилена соответственно, или алкиловые эфиры полиэтиленглико- ля

с,н,г„,10(с,)„н,

где п 10 - 18;

m 6 - 10, или хлориды алкилтриметиламмония

t(CH3),H,j,,JCr

где

Ъ h

п 7 и алкилдиметилбензиламмония C(CH.j),j, ),СбН С1где п 10 - 18о