Способ определения функциональной активности альвеолярных макрофагов у больных туберкулезом Советский патент 1992 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к медицине, а именно к физиопульмонологии, и может быть использовано в ле очно-терапевтиче- ских стационарах и поликлиниках практических противотуберкулезных учреждений для определения функциональной активности альвеолярных макрофагов.

Цель изобретения - упрощение способа.

Способ осуществляют следующим образом.

Мононуклеары и полинуклеары выделяют из 2 мл цельной крови, стабилизированной гепарином (50 ед/мл) и разведенной питательной средой № 199 в отношении 1:1.

Полученные 4 мл наносят H.I двойной градиент плотности растворов фикола с ве- рографином: нижний слой (3 мл) с плотностью 1,119 г/см3 и верхний (3 мл) - 1,077 г/см3 и центрифугируют 45 мин при 30 при комнатной температуре. После центрифугирования на границах раздела растворов появляются два кольца: нижнее составляет полиморфноядерные лейкоциты (99-100%), верхние - мононуклеары, среди которых содержание моноцитов достигает 15-20%, а число полинуклеаров не превышает 2%.

Каждый слой клеток отсасывают пастеровской пипеткой и 1 раз отмывают физиологическим раствором в соотношении 1:10. К полученному клеточному осадку добавляют 1 мл от раствора и тщательно суспендируют.

Для оценки жизнеспособности клеток к 0,05 мл клеточной суспензии добавляют 0,05 мл 1 %-ного раствора трипанового сиXJО vj х|

него и инкубируют при комнатной температуре не больше 1 мин. Для подсчета клеток к 0,05 мл суспензии приливают 0,05 мл 0,1%-ного раствора метиленового синего и инкубируют 15-20 мин. Оценку жизнеспособности и подсчет количества клеток проводят в камере Горяева.

Постановку теста восстановления нит- росинего тетразолия (НСТ-теста) осуществляли в 2 этапа - для нативных клеток (спонтанный НСТ-тест)) и после стимуляции убитой культурой вакцины Кальметта и Ге- рена (БЦЖ) (стимулированный тест). Все этапы, начиная с забора крови, проводят в силиконированной посуде.

Для каждого вида клеток в 2 параллельные пробирки помещают объем взвеси, содержащей около 0,5 10б клеток. Одна пробирка служит для постановки спонтанного, другая - для стимулированного теста. В пробу со стимулированным тестом добавляют взвесь 3-недельной убитой культуры БЦЖ в питательной среде № 199, содержащей 108 микробных тел в 1 мл. Объем добавляемой взвеси определяется отношением 1 клетка: 10 микробных тел. Пробирку помещают в термостат при 37°С на 20 ч.

Пробирку для спонтанного НСТ-теста центрифугируют в течение 5 мин при 140 д, надосадочную жидкость сливают, а к осадку клеток добавляют 0.2 мл приготовленного одновременно 0,2%-ного раствора нитро- синего тетразолия в 0,05 М фосфатном буфере рН 7,4. Пробу помещают в термостат при 37°С на 1 ч, после чего центрифугируют 5 мин при 330, супернатант сливают, к осадку клеток добавляют 0,2 мл диметилсуль- фоксида. После растворения осадка доводят объем до 3 мл фосфатным буфером 0,05 М рН 7,4, Полученную смесь вновь центрифугируют 10 мин при 330 ив надосадоч- ной жидкости определяют оптическую плотность на СФ-26 при длине волны 492 нм против контроля на реактивы (2,8 мл фосфатного буфера и 0,2 мл диметилсульфокси- да). Результаты выражают в единицах оптической плотности, умноженных на 1000, в пересчете на 106 клеток,

Индукцировэнный тест после 20-часовой инкубации проводят аналогичным образом.

Помимо цифровых значений спонтанного и стимулированного НСТ-теста рассчитывали коэффициент стимуляции (КС) как отношение второго показателя к первому.

У здоровых спонтанный НСТ-тест с мо- нонуклеарами составлял 33,0 ± 4,9, стимулированный 200,1 ± 25,3, КС 6,9 ± 1,1, с

полинуклеарами 56,6 ±4,0, 132,6 ± 11,8 и 2,4 ±0,3 соответственно.

Пример 1. Больной X., 32 лет, диагноз: очаговый туберкулез верхней доли правого

легкого в фазе инфильтрации, Туберкулез выявлен впервые. Бронхологическое исследование с одновременным исследованием периферической крови произведено на 10-й день со времени поступления в клинику. У

данного больного показатель спонтанного НСТ-теста альвеолярных макрофагов (AM) составил 44,7, мононуклеаров 56,2, нейтрофилов 35,7, величина стимулированного НСТ-теста была равной 210, 498,7 и 185,7,

соответственно. При этом коэффициент стимуляции AM оказался равным 4,6, мононуклеаров 8,8 и нейтрофилов 5,2.

Приведенный пример свидетельствует о том, что при ограниченных формах

туберкулеза легких с относительно благоприятным его течением показатели функционального состояния AM, мононуклеаров и нейтрофилов изменяются однонаправлен- но и характеризуются незначительным повышением спонтанного НСТ-теста при высоких значениях коэффициента стимуляции.

Таким образом, у данного больного повышенные значения КС мононуклеаров и

нейтрофилов периферической крови по сравнению со здоровыми указывали на высокую функциональную активность AM, под- твержденную проведением у данного больного бронхоскопии и определением

НСТ-теста с AM бронхоальвеолярного смыва.

Пример 2. Больная 35 лет, диагноз: инфильтративный туберкулез верхней доли правого легкого в фазе распада (деструктивный туберкулез) МТ + туберкулез легких выявлен впервые. Бронхологическое исследование с одновременным исследованием крови произведены на 15-й день госпитализации. У больной показатель

спонтанного НСТ-теста AM составил 92.1, мононуклеаров 48,6 и нейтрофилов 86,4, величины стимулированного НСТ-теста были равны 285,5; 208,9 и 181,4 соответственно. При этом коэффициент стимуляции был снижен и оказался равным для AM 3,1, мононуклеаров 4,3 и нейтрофилов 2,1.

Данный пример свидетельствует о том, что при деструктивных формах туберкулеза легких с относительно неблагоприятным его

течением показатели функционального состояния AM, мононуклеаров и нейтрофилов также носили однонаправленный характер и отличались высоким уровнем спонтанного НСТ-теста при ограничении резервов стимуляции. У данной больной низкие значения коэффициента стимуляции мононуклеа- ров и нейтрофилов периферической крови сами по себе указывали на низкую функциональную активность AM, подверженных проведением у больной бронхоскопии определением НСТ-теста с AM бронхоальвео- лярного смыва.

В качестве прототипа выбран способ непосредственного определения спонтан ного и стимулированного НСТ-теста в альвеолярных макрофагах, полученных из бронхоальвеолярного смыва.

По сравнению с прототипом предлагаемый способ проще, т.е. позволяет отказаться от проведения бронхоскопии и бронхоальвеолярного лаважа.

Точность рбоих способов была одинаковой (см, таблицу).

Формула изобретения Способ определения функциональной активности альвеолярных макрофагов у больных туберкулезом легких, включающий

инкубацию клеток в присутствии туберкулезного микроба штамм БЦЖ с последующей инкубацией с нитросиним тетразолием и вычислением коэффициента стимуляции его восстановления, отличающейся

тем, что, с целью упрощения способа, в качестве клеток используют мононуклеары и полинуклеары. выделенные из крови больных, и при увеличении коэффициента стиму- ляции восстановления тетразолия

нитросинего у больных по сравнению со здоровыми определяют высокую функциональную активность альвеомерных макрофагов, при коэффициенте стимуляции у больных меньшем, чем у здоровых, определяют низкую функциональную активность альвеомерных макрофагов у больных туберкулезом.

Изобретение относится к медицине1, а именно к физиопульмонологии, и может быть использовано в легочно-терапевтиче- ских стационарах практических противотуберкулезных учреждениях для определения функциональной активности альвеолярных макрофагов у больных туберкулезом. Цель изобретения - упрощение способа. Берут кровь у здоровых и больных туберкулезом легких, выделяют мононуклеары и полинук- леары и по увеличению коэффициента стимуляции убитой культурой БЦЖ в тесте восстановления нитросинего тетразолия определяют высокую, а при снижении по сравнению со здоровыми низкую функциональную активность альвеолярных макрофагов. Предлагаемый способ имеет равную точность в сравнении с прототипом и позволяет исключить бронхоскопию с забором бронхоальвеолярного смыва. сл с