СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ТУБЕРКУЛЕЗНОЙ ИНФЕКЦИИ Российский патент 2010 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к области медицины, а именно к фтизиатрии, и может быть использовано для определения стадии туберкулезной инфекции.

В России заболеваемость туберкулезом в 2001 г. достигла 87,3 на 100 тыс.населения [Аксенова В.А. Противотуберкулезная помощь детям и подросткам. // Тезисы докладов с симпозиума в рамках итоговой коллегии МЗ РФ. - Москва, 2002 - с.29] и сохраняется на этом уровне до настоящего времени. Исход взаимодействия микобактерий туберкулеза (МБТ) и макроорганизма зависит от многих причин. При первичном попадании МБТ в организм человека происходит изменение гомеостаза. Человек остается инфицированным на всю жизнь при положительном результате пробы Манту, но проявлений болезни не отмечается. Этот вид аллергической диагностики заболевания туберкулезом проводится с 12-месячного возраста и выбран нами в качестве прототипа.

Внутрикожную пробу Манту проводят строго в асептических условиях. Одноразовым туберкулиновым шприцом со стерильной иглой №845 набирают 0,2 мл туберкулина, затем на шприц надевают прилагаемую к нему стерильную иглу и в ватный тампон выпускают туберкулин вместе с пузырьками воздуха до метки 0,1 мл. Кожу средней трети внутренней поверхности предплечья обрабатывают 70° этиловым спиртом и просушивают стерильной ватой. Кожу фиксируют снизу левой рукой так, чтобы на внутренней поверхности она была натянута, и вводят строго внутрикожно 0,1 мл препарата. При этом образуется инфильтрат беловатого цвета (лимонная корочка) диаметром 8-10 мм. Результат учитывают через 72 часа по размеру гиперемии или инфильтрата (приказ МЗ РФ «Совершенствование противотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации» от 21.03.2003 г.). Проба Манту считается отрицательной при уколочной реакции; сомнительной - при гиперемии любого размера или инфильтрате 2-4 мм; положительной - при размере инфильтрата 5 мм и более [Перельман М.И. с соавт. // Фтизиатрия. - М.: Медицина, 2004. - С.519, с.95]. Измерение размера папулы - инфильтрата проводит медработник, который не всегда точно определяет границы инфильтрата, что может привести к ложной интерпретации результатов аллергической пробы. Кроме того, уточнить, когда произойдет переход стадии инфицирования в стадию заболевания с помощью данной пробы практически невозможно.

По мнению В.А.Аксеновой с соавт. [Аксенова В.А., Овсянкина Е.C., Александрова Т.М. Методы контроля качества работы при массовой туберкулинодиагностике. // Проблемы туберкулеза. - 2002, №2. - С.3-5] методы, позволяющие констатировать развитие туберкулезной инфекции у лиц с измененной туберкулиновой чувствительностью, на современном этапе отсутствуют.

Диагностическая ценность пробы Манту значительно снижается из-за наличия поствакцинальной аллергии, сохраняющейся до 5 лет после прививок против туберкулеза, а также с увеличением числа инфицированных лиц МБТ в старших возрастных группах [Бородулина Е.А., Бородулин Б.Е. Дифференциальная диагностика поствакцинальной и инфекционной туберкулиновой аллергии у детей с атопическими заболеваниями. // Проблемы туберкулеза и болезней органов дыхания. - 2006, №1. - С.9-13]. В связи с этим у детей 10-17 лет в половине случаев диагноз «Туберкулез» ставят при активном обращении в поликлинику по поводу жалоб, не связанных с туберкулезной инфекцией. Обычно в этот период формируются осложненные и распространенные формы туберкулеза.

Рентгенодиагностика позволяет выявлять только локальные формы туберкулеза и применение этого метода ограничено из-за облучения пациентов рентгеновскими лучами.

Задачей настоящего изобретения является разработка способа донозологической диагностики туберкулеза на основании изменений иммунологических показателей.

Технический результат предлагаемого способа основан на определении количества моноцитов с рецептором CD14⁺, обуславливающих взаимодействие с МБТ, уровня нейтрофилов, способных ограничивать очаг воспаления в результате реакции спонтанного восстановления нитросинего тетразолия, синтеза мелкомолекулярных иммунных комплексов (ЦИК 7,5%), отражающих суммарную активность гуморального и фагоцитарного звеньев иммуногенеза, иммуноглобулинов класса Е (IgE), являющихся косвенным показателем активации неадекватного для туберкулезной инфекции Th2 пути иммунного ответа и кортизола, который является маркером нейроэндокринных дисфункций, влияющих на работу иммунной системы.

Технический результат достигается тем, что способ диагностики туберкулезной инфекции основан на выявлении отклонения от нормы в пределах двух ошибок количества моноцитов с рецептором CD14⁺, мелкомолекулярных иммунных комплексов (ЦИК 7,5%), IgE, кортизола и уровня биоцидной активности нейтрофилов в тесте спонтанного восстановления нитросинего тетразолия (НСТ-спонт).

Сущность способа достигается тем, что в основе способа диагностики туберкулезной инфекции лежит не только аллергическая перестройка организма, но и выявление комплекса иммунологических показателей, имеющих корреляционные взаимоотношения со всеми иммунологическими параметрами при патологическом процессе, вызванным туберкулезной инфекцией.

Предлагаемый способ осуществляют следующим образом.

У больного берут кровь по 5 мл в 2 пробирки, одна из которых (1) содержит 250 мкл гепарина [разводим 5000 ЕД гепарина (5 мл) в 62,5 мл физиологического раствора]. Обе пробирки центрифугируют при 1500 об/мин в течение 30 мин на градиенте фиколл-верографина, затем удаляют надосадочную жидкость. В пробирке с гепарином (1) рецепторы к липополисахаридам (CD14⁺) на моноцитах (Мц) определяют методом проточной цитофлюориметрии на аппарате «FACScan» фирмы "Becton Dicenson» при добавлении моноклональных антител, меченных FITS. Содержимое второй (2) пробирки делят на 2 части. В содержимом одной части определяют восстановление нитросинего тетразолия (НСТ) в спонтанном тесте без добавления пирогенала (3). Пробу инкубируют при температуре 37°С в течение 30-40 мин, центрифугируют при 1500 об/мин в течение 30 мин, прореагировавшие клетки наносят на предметное стекло и подсчитывают количество клеток, используя световой микроскоп с увеличением в 630 раз. Из другой части (4) цельной крови получают сыворотку и определяют количество циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК 7,5%) с добавлением полиэтиленгликоля (ПЭГ) 7,5% концентрации (5) и учитывают результат с помощью спектрофотометра. Оставшуюся часть сыворотки вносят в планшеты с реактивами для определения концентрации IgE (6) и кортизола (7) в реакции иммуноферментного анализа (ИФА). Планшеты инкубируют в термостате при температуре 37°С в течение 30 мин, затем учитывают результаты на спектрофотометре. Принципиальная схема проведения лабораторных исследований отражена на чертеже.

Примеры конкретного использования способа

Пример 1

Больной X., 1992 года рождения, обратился в ГЛПУ ТО «ОПТД» по направлению фельдшера из школы с жалобами на зуд в области постпрививочного знака БЦЖ, увеличение его в размере в течение последнего года. БЦЖ поставлена в роддоме - рубец 12 мм. Проба Манту положительная во все годы наблюдения. 12.03.2007 г. поставлена проба Манту - размер папулы 15 мм.

У больного взяли кровь в количестве по 5 мл в 2 пробирки, одна из которых содержала гепарин. Обе пробирки центрифугировали при 1500 об/мин в течение 30 мин на градиенте фиколл-верографина, затем удаляли надосадочную жидкость. В пробирке с гепарином рецепторы к липополисахаридам на моноцитах (CD14⁺) определяли методом проточной цитофлюориметрии на аппарате «FACScan» фирмы "Becton Dicenson» при добавлении моноклональных антител, меченных FITS. Содержимое второй пробирки делили на 2 части. Из одной части готовили спонтанный тест для определения восстановления нитросинего тетразолия (НСТ) без добавления пирогенала. Пробу инкубировали при температуре 37°С в течение 30-40 мин и центрифугировали при 1500 об/мин в течение 30 мин. Прореагировавшие клетки наносили на предметные стекла и подсчитывали, используя световой микроскоп с увеличением в 630 раз. Из другой части цельной крови получали сыворотку и определяли количество циркулирующих иммунных комплексов с добавлением полиэтиленгликоля (ПЭГ) 7,5% концентрации, затем учитывали результат с помощью спектрофотометра. Оставшуюся часть сыворотки вносили в планшеты с реактивами для определения концентрации IgE и кортизола в реакции ИФА. Планшеты инкубировали в термостате при температуре 37°С в течение 30 мин, затем учитывали результаты на спектрофотометре.

Результат иммунологического обследования:

CD14⁺ - 88,2% (норма - от 72,4 до 98,4%)

НСТ-спонт - 18% (норма - от 10,5 до 19,3%)

ЦИК 7,5% - 43 усл. ед. опт. пл. (норма - от 27,3 до 186,5 усл. ед. опт. пл.)

IgE - 24,1 МЕ/мл (норма - до 100 МЕ/мл)

Кортизол - 237 нмоль/л (норма - от 200,0 до 544,9 нмоль/л).

Показатели тестов CD14⁺ НСТ-спонт, ЦИК 7,5%, IgE, кортизола были в пределах физиологических норм здорового человека.

Заключение. У больного туберкулезной инфекции нет. Клинический диагноз: Келлоидный рубец.

Пример 2

Больная А., 1994 года рождения, поступила в стационар ГЛПУ ТО «ОПТД» 26.07.2007 г. с жалобами на субфебрилитет в течение 3 мес., сухой кашель в течение 2 мес. БЦЖ поставлена в роддоме - рубец 8 мм. Проба Манту положительная с рождения, в 2004 г. увеличение папулы на 6 мм. В ноябре 2006 г. поставлена проба Манту - размер папулы 11 мм.

У больной взяли кровь по 5 мл в 2 пробирки, одна из которых содержала 250 мкл гепарина. Пробирки центрифугировали при 1500 об/мин в течение 30 мин на градиенте фиколл-верографина, затем удаляли надосадочную жидкость. В пробирке с гепарином рецепторы к липополисахаридам на моноцитах (CD14⁺) определяли методом проточной цитофлюориметрии на аппарате «FACScan» фирмы "Becton Dicenson» при добавлении моноклональных антител, меченных FITS. Содержимое второй пробирки делили на 2 части. Из одной части готовили спонтанный тест для определения восстановления нитросинего тетразолия (НСТ) без добавления пирогенала. Пробу инкубировали при температуре 37°С в течение 30-40 мин и центрифугировали при 1500 об/мин в течение 30 мин. Прореагировавшие клетки наносили на предметные стекла и изучали под микроскопом путем простого подсчета. Из другой части крови получали сыворотку и определяли количество циркулирующих иммунных комплексов с добавлением полиэтиленгликоля (ПЭГ) 7,5% концентрации. Учет результата проводили на спектрофотометре. Оставшуюся часть сыворотки вносили в планшеты с реактивами для определения концентрации IgE и кортизола в реакции ИФА. Планшеты инкубировали в термостате при температуре 37°С в течение 30 мин, затем учитывали результат на спектрофотометре.

Результат иммунологического обследования:

CD14⁺ - 77,7% (норма - от 72,4 до 98,4%)

НСТ-спонт - 49% (норма - от 10,5 до 19,3%)

ЦИК 7,5% - 145 усл. ед. опт. пл. (норма - от 27,3 до 186,5 усл. ед. опт. пл.)

IgE - 384 МЕ/мл (норма - до 100 МЕ/мл)

Кортизол - 1133 мкм/л (норма - от 200,9 до 544,9 нмоль/л).

Показатели тестов НСТ-спонт, IgE, кортизола были выше физиологических норм здорового человека.

Заключение. У больной туберкулезная инфекция.

Клинический диагноз: Инфильтративный туберкулез 6 сегмента правого легкого, фаза распада и обсеменения. МБТ(+) 1А группа. Заключение: учитывая положительную пробу Манту с рождения, можно предположить, что поствакцинальная аллергия сменилась развитием постинфекционной аллергии без документально подтвержденного угасания. Выявленные изменения по рентгенограмме свидетельствуют о давности специфического воспаления, приведшего к распаду легочной ткани и обсеменения окружающей ткани.

Пример 3

Больная Б., 1990 года рождения, поступила в стационар ГЛПУ ТО «ОПТД» в 15.07.2007 г. Жалоб не предъявляет. БЦЖ в роддоме - рубец 4 мм. Проба Манту положительная монотонная с рождения. 15.07.2007 г поставлена проба Манту - папула 12 мм.

У больной взяли кровь по 5 мл в 2 пробирки, одна из которых содержала 250 мкл гепарина. Обе пробирки центрифугировали при 1500 об/мин в течение 30 мин на градиенте фиколл-верографина, затем удаляли надосадочную жидкость. В пробирке с гепарином рецепторы к липополисахаридам на моноцитах (CD14⁺) определяли методом проточной цитофлюориметрии на аппарате «FACScan» фирмы "Becton Dicenson» при добавлении моноклональных антител, меченных FITS. Содержимое второй пробирки делили на 2 части. Из одной части готовили спонтанный тест для определения восстановления нитросинего тетразолия (НСТ) без добавления пирогенала. Пробу инкубировали при температуре 37°С в течение 30-40 мин и центрифугировали при 1500 об/мин в течение 30 мин. Прореагировавшие клетки наносили на предметное стекло и подсчитывали количество клеток, используя световой микроскоп с увеличением в 630 раз. Из другой части цельной крови получали сыворотку и определяли количество циркулирующих иммунных комплексов с добавлением полиэтиленгликоля (ПЭГ) 7,5% концентрации. Учитывали результат с использованием спектрофотометра. Оставшуюся часть сыворотки вносили в планшеты с реактивами для определения концентрации IgE и кортизола в реакции ИФА. Планшеты инкубировали в термостате при температуре 37°С в течение 30 мин, затем учитывали результаты на спектрофотометре.

Результат иммунологического обследования:

CD14⁺ - 71,7% (норма - от 72,4 до 98,4%)

НСТ-спонт - 49% (норма - от 10,5 до 19,3%)

ЦИК 7,5% - 118 усл. ед. опт. пл. (норма - от 27,3 до 186,5 усл. ед. опт. пл.)

IgE - 110 МЕ/мл (норма - 100 МЕ/мл)

Кортизол - 769 нмоль/л (норма - от 200,0 до 544,9 нмоль/л)

Показатели тестов НСТ-спонт, IgE, кортизола были выше физиологических норм здорового человека.

Заключение. У больной активная форма туберкулеза.

Клинический диагноз: Инфильтративный туберкулез 1-2 сегмента правого легкого, фаза распада. МБТ(-) 1А гр.

Приведенные примеры иллюстрируют возможность применения предложенного способа для диагностики активных форм туберкулеза.

Предложенный способ апробирован на базе ГЛПУ ТО «ОПТД» и ГЛПУ ТО «Противотуберкулезный санаторий Верхний Бор». Под наблюдением находилось 60 больных. В таблице представлены материальные затраты на проведение диагностики туберкулезной инфекции у одного больного при использовании пробы Манту и предлагаемого способа. Экономической эффект диагностики туберкулеза по сравнению с прототипом на 100 больных составляет 8056 руб.

Предложен простой способ, не требующий больших материальных затрат, в 3 раза превышает эффективность лабораторной диагностики по сравнению с постановкой пробы Манту, в 75% обеспечивает совпадение диагностики туберкулеза с результатами клинического обследования больного и позволяет проводить донозологическую диагностику развития туберкулезной инфекции.

Таблица Манипуляции, тесты, препараты Проба Манту (прототип) Предлагаемый способ диагностики туберкулезной инфекции Осмотр врача 115 руб 28 коп 0 руб 00 коп Проведение медсестрой внутрикожной манипуляции 30 руб 00 коп 0 руб 00 коп Взятие крови из вены 0 руб 00 коп 50 руб Комплекс исследований 0 руб 00 коп CD14⁺ - 110 руб     НСТ-спонт - 55 руб     ЦИК 7,5% - 33 руб     IgE - 110 руб     Кортизол - 72 руб Введение туберкулина 50 руб 0 руб 00 коп Чтение результата 115 руб 28 коп 0 руб 00 коп При сомнительном результате проведение р. Пирке 200 руб 00 коп 0 руб 00 коп Частота назначений специфической химиопрофилактики по данным пробы Манту 30 человек (фтивазид по 50 руб на 3 мес., т.е. 150 руб/курс/человек)   Частота назначений специфической химиопрофилактики по данным способа   13 человек (фтивазид по 50 руб на 3 мес., т.е. 150 руб/курс/человек) Рентгенобследование 0 руб 00 коп 0 руб 00 коп Повторный осмотр 115 руб 28 коп 115 руб 28 коп Итого 625 руб 84 коп 545 руб 28 коп

Изобретение относится к области медицины, а именно к фтизиатрии, и касается способа диагностики туберкулезной инфекции. Способ заключается в изучении показателей количества рецепторов к липополисахаридам на моноцитах (CD14⁺) в пробе крови с гепарином; уровня биоцидной активности нейтрофилов при восстановлении нитросинего тетразолия без добавления пирогенала (НСТ-слот), количества циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК 7,5%), содержания кортизола и иммуноглобулина класса Е (IgE) в пробе крови без гепатина. В случае превышения значения показателей НСТ-слот 19,3%, IgE 100 МЕ/мл и кортизола 544,9 нмоль/л диагностируют туберкулезную инфекцию. Использование способа позволяет повысить точность выявления туберкулезной инфекции. 1 табл., 1 ил.

Способ диагностики туберкулезной инфекции включает забор крови у пациентов по 5 мл в две пробирки, одна из которых содержит 250 мкл гепарина, пробирки центрифугируют, удаляют надосадочную жидкость; в пробе крови из пробирки с гепарином определяют содержание рецепторов к липополисахаридам на моноцитах (CD14⁺) методом проточной цитофлюориметрии с добавлением меченых моноклональных антител; в пробе второй пробирки определяют уровень биоцидной активности нейтрофилов при восстановлении нитросинего тетразолия без добавления пирогенала (НСТ-спонт), определяют количество циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК 7,5%) с добавлением полиэтиленгликоля (ПЭГ) с помощью спектрофотометра, содержание кортизола и иммуноглобулина класса Е (IgE) определяют с помощью иммуноферментного анализа (ИФА), а диагноз туберкулезной инфекции ставят на основании увеличения показателей НСТ-спонт выше 19,3%, IgE более 100 МЕ/мл и кортизола, превышающего 544,9 нмоль/л.