Способ получения сыворотки для иммунодиагностики ящура животных Советский патент 1992 года по МПК A61K39/42 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к ветеринарной иммунологии и может быть использовано в производстве диагностических сывороток для определения типовой и штаммоспеци- фической принадлежности вируса ящура в иммунологической реакции

Известны способы получения диагностических сывороток с использованием разных схем гипериммунизации морских свинок ящурным антигеном и применением различных адъювантов.

Известен способ получения штаммос- пецифических ящурных сывороток для серологических реакций

Способ включает следующие этапы Вначале заражают морских свинок массой 450-500 г введением в кожу подушечек задних конечностей 0,2 мл 10 %-ной суспензии афтозного вируса ящура. Затем отбирают в качестве продуцентов сыворотки морских свинок, заболевших генерализованной формой ящура. Через 30-45 дней отобранным морским свинкам 2-3 раза внутримышечно

в области бедра вводят 20%-ную суспензию афтозного вируса на 1/15 М фосфатном буферном растворе сапонина.

Через 10 дней после последней иммунизации животных обескровливают и получают иммунную сыворотку.

Кроме того, известен способ получения сывороток для иммунодиагностики ящура животных, включающий иммунизация кроликов введением 10%-ной суспензии вируса ящура на физиологическом растворе (вирус для гипериммунизации получают из мышечной ткани крольчат, прошедших не менее 12 пассажей).

Суспензию вируса вводят кроликам- продуцентам одновременно внутримышечно и внутривенно в области бедра и ушную вену по 2 мл Всего делают шесть инъекции вируса с интервалом между введениями 8 дней Забор крови осуществляют на 10-й день после последней инъекции. Полученные сыворотки проверяют в реакции связывания комплемента (РСК) на активность и

СО

с

g

оо

О

ю

специфичность, Результаты титрования сывороток: типа С - 1:16, типа О - 1:10.

Таким образом, известный способ, как и другие подобные, не позволяет; получить сыворотку высокой активности и специфичности,

Цель изобретения - повышение активности и специфичности сыворотки, а также сокращение процесса иммунизации.

Способ осуществляют следующим образом. Кроликов массой 2,5-3,0 кг иммунизируют коммерческой инактивированной эмульсионной вакциной против ящура животных с содержанием 32-120 мкг/мл 146 S антигена. Вакцину вводят дважды в дозе 2 ± 0,2 мл внутримышечно с интервалом 21-24 дня, а через 7-8 дней после второй инъекции антигена осуществляют забор крови.

Тотальное обескровливание кроликов проводят путем взятия крови из сердца Полученную кровь выдерживают в течение 1,5-2 ч в термостате при 37 ± 2°С, затем обводят сгусток пастеровской пипеткой и оставляют кровь в холодильнике (4°С) на 16-18 ч, после чего центрифугируют при 2000юб/мин (или просто сливают). Полученную сыворотку разводят физиологическим раствором 1:2 и инактивируют в водяной бане при 60 ± 2°С. Затем проверяют в реакции связывания комплемента (РСК) с гомологичными и гетерологичными антигенами.

Гомологичный антиген - это антиге на который получена сыворотка.

Для иммунизации кроликов-продуцентов используют эмульсионную противо- ящуриую вакцину.

П р и м е р 1. Группу из 6 кроликов вакцинируют эмульсионной противоящур- ной моновакциной из штамма вируса ящура типа О № 194. Препарат, содержащий 120 мкг/мл 146 S антигена, вводят в объеме 2 мл внутримышечно, Спустя 7, 14 и 21 день проводят повторную вакцинацию кроликов. Вакцину с такой же концентрацией 146 S антигена вводят в объеме 2,0 мл внутримышечно. Через 8 дней после второй вакцинации берут кровь, получают сыворотку и проверяют ее активность в РСК на наличие типоспецифических антител к вирусу ящура типа О.

Результаты реакции учитывают визуально по степени задержки гемолиза эритроцитов и выражают в крестах,

Предельным титром сыворотки считают ее наивысшее разведение, дающее с гомологичным антигеном, взятым в удвоенном рабочем титре (Р.Т.), задержку гемолиза 90- 100% эритроцитов.

Результаты опыта, приведенные в табл. 1, показали, что сыворотки, полученные при введении вакцины с интервалом 21 день, обладают более высокой активностью.

Пример 2, Двум группам кроликов

массой 2,5-3,0 кг вводят эмульсионную про- тивоящурную моновакцину из штамма вируса ящура А22 с содержанием 120 мкг/мл 146 S антигена в дозе 2,0 мл.

Одну группу повторно вакцинируют

введением такой же дозы преперата через 21 день, а вторую четырехкратно: на 7, 14, 21 и 28 день. Обескровливание кроликов про. одят через 8 дней после последней иммунизации. Результаты исследования приведены в табл. 2.

Проведенные исследования свидетельствуют о том, что увеличение кратности введения специфического антигена не дает

увеличения титра антител в сыворотках крови гипериммунизированных кроликов.

П р и м е р 3. Группу из 8 кроликов массой 2,5-3,0 кг иммунизируют введением моновалентной эмульсионной противоящурной вакцины на основе вируса ящура типа А22 № 550 серии 85.

Препарат, содержащий 32 мкг/мл 146 S антигена, вводятживотным внутримышечно в объеме 2,0 мл. Через 24 дня после первого

введения вакцину инокулируют кроликам повторно в том жеобъеме. На 7-й день после второго введения вакцины кроликов обескровливают.

Полученную после оттаивания и центрифу ирования крови сыворотку разводят физиологическим раствором 1.2, инактивируют прогреванием при 60 ± 2°С в течение 40 мин и проверяют в РСК на активность и штаммоспецифичность.

Исследования показали, что полученная по предложенному способу сыворотка активна в разведении 1:256 с гомологичным антигеном и дзет отрицательные результаты с гетерологичными антигенами вируса

ящура типов О и С.

П р и м е р 4, Группе кроликов вводят вакцину из штамма вируса ящура типа О № 194 с содержанием 80 мкг/мл 146 S антигена. Повторную гипериммунизацию проводят через 21 день и обескровливают кроликов через 1 дней после повторного введения, Полученную после отстаивания и центрифугирования сыворотку после инактивации проверяют в РСК на типо- и штаммоспецифичность с гомологичными и гетерологичными a тигенами

Сыворотка, полученная на введение средних доз (80 мкг/мл) 146 S антигена типа О № 194, активна в разведении 1:256.

П р и м е р 5, Группе кроликов вводят 2 мл вакцины с содержанием 50 мкг/мл 146 S антигена Аа2. Повторную гипериммуниза- цию проводят через 24 дня и животных обескровливают через 8 дней после повторного введения. После отстаивания и центрифугирования сыворотку проверяют в РСК с гомологичными и гетерологичными антигенами типов О и С. Сыворотка активна в разведении 1:256, кроме того, она типо- и штаммос- пецифична.

Таким образом, оптимальный интервал между введением вакцины для гипериммунизации составляет 21-24 дня.

Пример 6. В реакции связывания комплемента (РСК) проводят сравнительное титрование сыворотки, полученных по предлагаемому способу и производственных.

Результаты сравнительного титрования приведены в табл. 3. Из табл. 3 видно, что сыворотки, полученные по предлагаемому способу, по активности значительно превосходят производственные, когда в качестве продуцентов используют морских свинок.

В табл. 3 в первых трех строчках показан контроль главного опыта, в котором использованы биофабричные сыворотки и антигены.

В табл. 4 показана активность полученных сывороток от кроликов (две строки), которая составляет 1:256 с гомологичным антигеном А22 и О № 194.

Для сравнения приведены данные по активности диагностических, (биофабрич- ных)сывороток, полученных путем гипериммунизации морских свинок (две нижние строки), которые активны с гомологичными антигенами А22 и О № 194 в разведении 1:32

По существующим требованиям специфичность сыворотки не должна превышать 5% по отношению к ее активности. Из табл. 4 видно, что сыворотки, полученные по предлагаемому способу, более специфичны (начиная с разведения 1:4) при активности 1:256.

Пример. Таким образом проведенные исследования свидетельствуют о том,

что предложенная в качестве специфического антигена коммерческая вакцина с содержанием 146 S антигена 32-120 мкг/мл и схема двукратной иммунизации таких доноров, как кролики, позволяют получить высокоактивные типо- и штаммоспецифические ящурные сыворотки для диагностических целей.

Предлагаемый способ предназначен для получения сыворотки с целью иммунодиагностики ящура. Исследованию может быть подвергнут любой афтозный материал, полученный от всех видов восприимчивых животных (все виды парнокопытных), а также лабораторных (вируссодержащая ткань от крольчат, морских свинок и вирус, полученный в первичных культурах почки крольчонка и свиньи).

В табл. 4 приведены данные проверки активности культурального антигена, полученного в первичных культурах почек крольчонка и почки свиньи. Из табл. 4 видно, что обычной (биофабричной) сывороткой такой антиген уловить невозможно, в то время как, используя высокоактивную сыворотку, полученную по предлагаемому способу, активность проверяемых антигенов равна 1:4 и 1:8.

Формула изобретения

Способ получения сыворотки для иммунодиагностики ящура животных, предусматривающий иммунизацию кроликов - доноров сыворотки - ящурным антигенсо- держащим материалом, последующий забор крови и отделение целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью повышения активности и специфичности целевого продукта, кроликов иммунизируют внутримышечно дважды с интервалом между инъекциями 21-24 дня в качестве анти- генсодержащего материала используют коммерческую инактивированную эмульсионную вакцину против ящура животных с концентрацией 146 S антигена, равной 32 - 120 мкг/мл, а забор крови осуществляют через 7-8 дней после повторной иньекции антигена.

Таблица 1

Таблица 2

Использование: иммунодиагностика ящура животных Сущность изобретения кроликов иммунизируют внутримышечно 2 раза (интервал между инъекциями 21-24 дн) коммерческой инактивированной вакциной с содержанием 146 S антигена 32-120 мкг/мл. а забор крови осуществляют через 7-8 дн после второй иммунизации. Активность полученной сыворотки в реакции связывания комплемента с гомологичным антигеном составляет 1:256. 4 табл.

Примечание, т- титр сыворотки, т е. ее наивысшее разведение, способное купать в реакцию. Р.Т, - рабочий титр, это удвоенный титр, применяемый в реакции.

Таблица 3

1аблица 4