Способ получения биокатализатора в полисахаридном носителе Советский патент 1992 года по МПК C12N11/10 

Изобретение относится к прикладной микробиологии и биотехнологии и касается получения полисахаридных гранул, содержащих иммобилизованные включением в гель фурцелларана клетки бактерий.

Из известных носителей для получения иммобилизованного биокатализатора наиболее близким к предлагаемому является использование каппа-каррагинана для иммобилизации микроорганизмов путем включения в гель. Способ состоит в следующем: каррагинан растворяют в 0,9%-ном растворе хлорида натрия, нагревают до 60°С, охлаждают и при 40°С смешивают с суспензией клеток в соотношении 9:1 до конечной концентрации полимера 2%. При 40°С добавляют смесь из шприца по каплям в 3%-ный раствор хлорида калия, находящийся при комнатной температуре (22°С). После формирования гранул с клетками их оставляют на 20 мин при комнатной температуре для затвердения в растворе хлорида калия.

Недостатками известного способа являются низкая механическая прочность гранул и невысокая стабильность гранул биокатализатора в процессе использования.

Цель изобретения - повышение механической прочности целевого .продукта,

Поставленная цель достигается посредством использования в качестве материала для приготовления гранул водного раствора полисахарида фурцелларана смешиванием его с суспензией клеток и прокапыванием смеси в охлажденную двухфазную систему.

2

ГО

со

со

о

состоящую из вазелинового масла и 10%- ного раствора хлорида калия.

Способ получения иммобилизованных клеток состоит в следующем.

Фурцелларан помещают на 1 ч в 0,2%- ный раствор хлорида калия. Затем растворяют его при 80°С и постоянном перемешивании, охлаждают до 65°С и смешивают с суспензией клеток после чего про- капывают в двухфазную систему - вазелиновое масло и 10%-ный раствор хлорида калия при 5°С. Гранулы извлекают и промывают дистиллированной водой. Время, необходимое для формирования гранул, составляет 5-6 мин. Образовавшиеся гра- нулы имеют правильную сферическую форму и одинаковые размеры.

Пример 1. Готовят суспензию бактерий штамма Alcaligenes faecalis KSV2I в физиологическом растворе в концентрации 2 мг сухой массы клеток на 1 мл. 4 г фурцел- ларана помещают в 100 мл 0,2%-ного раствора хлорида калия на 1 ч при комнатной температуре (22°С), а затем перемешивают в течение 40 мин при 80°С. Готовый раствор полимера охлаждают до 65°С и смешивают с суспензией клеток в равных объемах до конечной концентрации полимера 2% и прокапывают в двухфазную систему, состоящую из вазелинового масла и 10%-ного раствора хлорида калия, охлажденную до 5°С. Сформировавшиеся сферические гранулы оседают на дно сосуда. Они имеют размеры 3 - 4 мм и не требуют дальнейшего фракционирования. Время нахождения гра- нул в 10%-ном растворе хлорида калия 10 мин. Механическая прочность гранул составляет 80 г/гранул.

Пример 2. Готовят суспензию клеток бактерий штамма Alcaligenes faecalis KSV- 21 в 0,9%-ном растворе хлорида натрия в концентрации 2 мг/мл сухой массы клеток. Каппа-каррагинан растворяют в 0,9%-ном растворе хлорида натрия при 60°С, затем охлаждают и при 40°С смешивают с суспен- зией клеток в соотношении 9:1 до конечной концентрации полимера 2% и прокапывают в 3%-ный водный раствор хлорида калия при комнатной температуре (22°С). После формирования гранул с клетками их остав- ляют на 20 мин в 3%-ном растворе хлорида калия. Механическая прочность гранул равна 25 г/гранулу.

Пример 3. Иммобилизацию клеточной суспензии штамма Pseudomonas pinida ТШ-18 в концентрации 1,7 г сухой массы на 1 мл проводят аналогично примеру 1. Подготовленные гранулы в количестве 10 г вносят в 100 мл синтетической минеральной среды следующего состава, г/л: №2НР04

6,0; КН2Р04 3,0; NaCI 0,5; NhUCI 1,0, содержащую в качестве единственного источника углерода и энергии неионогенное . юверхно- стно-активное вещество - синтанол ДС-10 в концентрации 0,5 г/л. Через 1 сут инкубации при 30°С при аэрации данный штамм разрушает субстрат до оста точной концентрации в среде культивирования 30 мг/л.

Пример 4. Свободные клетки штамма Pseudomonas putlda ТШ18 в концентрации 1,7 мг сухой массы на 1 мл в количестве 5 мл (соответствует 10 г биокатализатора) вносят в 100 мл синтетической минеральной среды следующего состава, г/л: NaaHPO/i 6,0; КН2Р04 3,0; NaCI 0,5; NhMCI 1,0, содержащей в качестве единственного источника уг- лерода и энергии неионогенное поверхностно-активное вещество - синтанол ДС-10 в концентрации 0,5 г/л. Через I сут инкубации при 30°С при аэрации данный штамм разрушает синтанол до концентрации 150 мг/л.

Пример 5. Иммобилизацию клеточной суспензии штамма Alcaligenes faecalis KSV-21 производят аналогично примеру 1. Приготовленные гранулы в количестве 10 г вносят в 100 мл синтетической минеральной среды следующего состава, г/л: Na2HP04 6,0; КН2Р04 3,0; NaCI 0,5; МЩС 1.0, содержащей в качестве единственного источника углерода и энергии фенол в концентрации 0,5 г/л. Через 3 сут инкубации при 30°С при аэрации данный штамм разрушает фенол до концентрации 20 мг/л.

Пример 6. Свободные клетки штамма Alcaligenes faecalis KSV-21 в концентрации 2 мг сухой массы клеток на 1 мл в количестве 5 мл (соответствует 10 г биокатализатора) вносят в 100 мл синтетической минеральной среды следующего состава, г/л: Na2HP04 6,0; КН2Р04 3,0; NaCI 0,5; NbUCI 1,0, содержащей в качестве единственного источника углерода и энергии фенол в концентрации 0,5 г/л. Через 3 сут инкубации при 30°С при аэрации данный штамм разрушает фенол до 20 мг/л.

Получение биокатализатора в полисаха- ридном носителе имеет следующие преимущества: механическая прочность гранул увеличивается в 4 - 5 раз, что создает возможность для более длительного использования(культивирования)в биотехнологических процессах с,иммобилизованными микроорганизмами; гранулы, сформированные предлагаемым способом, имеют одинаковые размеры, сферическую форму м не нуждаются в дальнейшем фракционировании.

Формула изобретения Способ получения биокатализэтора в полисахаридном носителе путем приготовления раствора полисахарида, охлаждения его и смешивания с суспензией клеток микроорганизма с последующим прокапыванием полученной смеси и формированием гранул, отличающийся тем, что, с целью повышения механической прочности целевого продукта, из полисахаридов выбирают фурцелларан, раствор готовят при 80°С в

0

течение 40 мин после предварительного набухания фурцелларана в растворе хлорида калия в течение 1 ч, полученный раствор охлаждают до 65°С и смешивают с суспензией клеток до конечной концентрации фурцелларана 1,5 - 3,0, а прокапывание осуществляют в охлажденную до 5°С двухфазную систему, состоящую из вазелинового масла и 10%-ного раствора хлорида калия.

Использование: прикладная микробиология и биотехнология. Сущность изобретения: полисахарид - фурцелларан, набухает в растворе хлорида калия в течение 1 ч, затем его перемешивают в течение 40 мин при 80°С, Полученный раствор охлаждают до 65°С и смешивают с суспензией бактериальных клеток до конечной концентрации фурцелларана 1,5 - 3%. Готовую смесь прокапывают в охлажденную до 5°С двухфазную систему, состоящую из вазелинового масла и 10%-ного раствора хлорида калия. При этом формируются гранулы биокатализатора с механической прочностью 80 г/гранулу. (Л