Способ определения тетрациклинов Советский патент 1992 года по МПК G01N30/90 

Изобретение относится к сельскому хозяйству, в частности к ветеринарии и может быть использовано при контроле качества меда.

Известен способ определения тетра- циклинов (в частности в сыворотке крови) путем добавления к пробе тетрациклина растворителя, нанесения полученной пробы на пластину для тонкослойной хроматографии, пропитанную предварительно 0,1 М раствором трилона Б, с последующей разгонкой в смеси этилацетата с ацетоном и водой.

Однако данный способ не может быть использован для идентификации и определения в меде остаточных количеств тетра- циклинов с высокой точностью

Целью изобретения является повышение точности способа при определении тетрациклина в меде

Для достижения поставленной цели согласно способу определениятетрациклииов путем добавления к пробе меда раствори, е- ля нанесения полученной пробы на пласт- ну для тонкослойной хроматографии предварительно 0,1 М раствором трилона Е, рН 4 5 - 4.8 с последующей разгонкой в смеси этилацетата с ацетоном и водой ь качестве растворителя используют смесь 0.005 - 0,015 н.раствора соляной кислоты и ацетона в объемном соотношении пробы соляной кислоты и ацетона 4.0 4 5.1 35- 40

Способ осуществляют следующим образом

Подготовка к анализу.

Для приготовления U.1 М раствора трилона Б. 3.76 г трилона Б вносят в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяют в небопьшом количестве воды объем раствоVJ

ГО XI

ы

pa в колбе доводят до метки водой, перемешивают. рН полученного раствора должен быть 4,5 - 4,8 (проверяют потенциометриче- ски); при необходимости рН раствора доводят до нужного значения 10%-ным раствором едкого натра.

Приготовление стандартных растворов тетрациклинов.

По 50 мг каждого антибиотика (тетра- циклин,окситетрациклин, метациклин и до- ксициклин) вносят в мерную колбу вместимостью 250 мл, прибавляют 10 мл 0,01 н. соляной кислоты, встряхивают до полного растворения, затем объем раствора в колбе доводят до метки ацетоном. Вносят 5 мл этого раствора в мерную колбу вместимостью 50 мл, доводят объем раствора в колбе до метки ацетоном (раствор 1).

Приготовление стандартного раствора доксициклина для определения всех тетра- циклинов.

Вносят 50 мг доксициклина гидрохлорида в мерную колбу вместимостью 250 мл, прибавляют 10 мл 0,01 н.раствора соляной кислоты, встряхивают до полного растворе- ния, объем раствора в колбе доводят до метки ацетоном, перемешивают. Вносят 5 мл этого раствора в мерную колбу вместимостью 50 мл и объем раствора в колбе доводят до метки ацетоном (раствор 2).

Подготовка пробы меда для анализа.

К 4,0 - 4,5 мл (4,5 - 5,5 г) меда в колбе с притертой пробкой прибавляют 1 мл 0,005- 0,015 н.соляной кислоты, тщательно перемешивают, растирают, прибавляют 3,5 - 4,0 мл ацетона, перемешивают (раствор 3).

Подготовка и регенерация хроматогра- фических пластин.

Готовые пластины для хроматографиро- вания (ТУ 15/16 ЭССР-7-88) многоразового использования размером 6x10 см помещают на 30 мин в 0,1 М раствор трилона Б (рН 4,5 - 4,8) для пропитывания. Пластины вынимают, сушат на воздухе в течение 2 - 3 ч и помещают в сушильный шкаф на 1 ч при 105 - 110°С для активирования. Охлажденная пластина готова для анализа.

После проведения хроматографическо- го анализа пластины регенерируют, помещая их в раствор хромовой смеси (осторожно) на 5-10 мин, пинцетом вынимают и переносят в сосуд для промывания в проточной воде в течение 30 мин. Окончательно каждую пластину промывают дистиллированной водой (100 мл), высушивают на воздухе, затем пропитывают раствором трилона Б и активируют, как указано выше

Приготовление подвижной фазы (система растворителей) для хроматографирова- ния.

В мерном цилиндре с притертой пробкой вместимостью 50-100 мл смешивают 20 мл этилацетата, 19 мл ацетона и 3 мл воды, подвижную фазу выливают в хрома- тографическую камеру с притертой крышкой.

Выполнение анализа.

На линию старта стеклянной пластины наносят следующие пробы в точки на расстоянии 1 см одна от другой и на 1,5 см от края нижнего пластины:

5 мкл раствора 1 (0.1 мкг каждого антибиотика);

5 мкг раствора 2 (0,1 мкг дексициклина),

5, 10 и 20 мкл раствора 3 (проба меда).

Пластину с нанесенными пробами высушивают на воздухе в течение 1 - 2 мин, помещают в камеру со смесью растворителей этитацетат:ацетон:вода (20:19:3) и хро- матографируют восходящим способом.

Когда фронт растворителей поднимется на 7 - 8 см от линии старта, пластину вынимают из камеры, сушат на воздухе 10 мин, лотом 5 мин в сушильном шкафу (при 100°С). После охлаждения пластину помещают на 3 - 5 мин в камеру с парами аммиака и затем просматривают в свете лучей УФ-лампы при длине волны 366 нм. На хроматограмме должны быть видны 4 зоны антибиотиков, пол- ученных при хроматографировании раствора 1:метациклин с Rsno доксицик - 0,47 ± 0,05; тетрациклин с Rsno доксицик 0,76 ± 0,05; доксициклин с Rsno доксицик 1,0 ± 0,05 и окситетрациклин с Rsno доксицик 1,18 ± 0,05. Сравнивают интенсивность свечения зон пятен веществ, полученных при хроматографировании раствора 3 (проба меда), нанесенного в разных количествах (от 5 до 20 мкл) с помощью микрошприца или пипетки с интенсивностью свечения зон пятен веществ, полученных при хрома- тографировачии раствора 1. Интенсивность зон свечения антибиотиков, полученных при хроматографировании раствора 3, должна быть не более интенсивности зон свечения антибиотиков, полученных при хроматографировании раствора 1.

Обнаруженное количество каждого антибиотика в пробе меда по предлагаемому способу составляет 0.0005% или 0,005 мг на 1 г меда.

П р и м е р 1. Помещают 4,0 мл меда (образец 1) в колбу с притертой пробкой, прибавляют 1 мл 0,005 н.соляь кислоты, перемешивают, растирают, ц.)5авляюг

3,5 мл ацетона. Пластины для хроматогра- фирования подготавливают так же, как указано выше, но рН 0,1 М раствора трилона Б равен 4,5; сушат на воздухе 2 ч и активируют при 105°С. На пластины наносят следующие пробы в точки на расстоянии 1 см одна от другой:

5 мкл раствора 1 (приготовление стандартного раствора тетрациклинов описано выше);

5 мкл раствора 2 (приготовление стандарта доксициклина для определения тетрациклина описано выше);

5, 10 и 20 мкл раствора 3 (проба меда).

При просматривании пластин после хроматографирования в свете УФ-лампы обнаружен окситетрациклин, интенсивность зоны свечения которого соответствует 0,01 мг антибиотика на 1 г меда.

В примере применяли 3 пробы меда. При использовании для определения остаточных количеств тетрациклинов известным способом не было обнаружено тетрациклинов ни в одной из проб.

П р и м е р 2. Определение осуществляют одновременно на 3 пробах меда (образец 2).К 4,5 мл меда в колбе с притертой пробкой прибавляют 1 мл 0,015 н.соляной кислоты, тщательно перемешивают, растирают, прибавляют 4,0 мл ацетона.

На линию старта подготовленной как указано выше хроматографической пластины, но с пропитыванием 0,1 М раствором трилона Б при рН 4,0 и сушке на воздухе 3 ч при активировании в шкафу со 110°С, нанося следующие пробы в точки:

5 мкл раствора 1 (стандарт - смесь тетрациклинов);

5 мкл раствора 2 (стандарт доксициклина);

5, 10 и 20 мкл раствора меда.

При просматривании пластины подУФ- лампой после процесса хроматографирова0

5

0

5

0

5

0

ния не обнаружено зон свечения тетрациклинов.

П р и м е р 3. Берут 3 пробы меда (образец 3) по 4,25 мл, к каждой пробе прибавляют 1 мл 0,01 н.соляной кислоты и 3,75 мл ацетона, далее все операции проводят как в примерах 1 и 2. Пластины пропитывают тем же раствором трилона Б, но рН 4,65, сушат на воздухе 2,5 ч, активируют при 107°С. На пластину наносят пробы в той же последовательности и количествах, как в примерах 1 и 2.

После проведения процесса хроматографирования и просматривания пластины в свете УФ-лампы обнаружена зона свечения окситетрациклина, интенсивность которой соответствует 0,005 мг антибиотика на 1 г меда.

Способ позволяет идентифицировать и определить остаточные количества антибиотиков из группы тетрациклина (тетрациклин, окситетрациклин, метациклин и доксициклин) на уровне 0,0005% или 0,005 мг на 1 г меда.

Формула изобретения

Способ определения тетрациклинов путем добавления к пробе, содержащей тетрациклин, растворителя, нанесения полученной пробы на пластины для тонкослойной хроматографии, предварительно пропитанных 0,1 М раствором трилона 6 с последующей разгонкой пробы в смеси зти- лацетата с ацетоном, отличающийся тем, что, с целью повышения точности спо соба при определении тетрациклина в меде, в качестве растворителя используют смесь 0,005 - 0,015 н.соляной кислоты с ацетоном, взятых в объемном соотношении проба:со- ляная кислота:ацетон, равном 4,0 - 4,5:1:3,5 - 4,0, а раствор трилона Б используют с рН 4,5 -4,8.

Изобретение относится к сельскому хозяйству, в частности к ветеринарии, и может быть использовано при контроле качества меда. Тетрациклины определяют путем добавления к пробе растворителя, нанесения пол- ученной пробы на пластины для тонкослойной хроматографии, предварительно пропитанные 0,1 М раствором трило- на Б, с последующей разгонкой пробы в смеси эталацетата с ацетоном. В качестве растворителя применяют смесь 0,005 - 0,015 н соляной кислоты с ацетоном при объемном соотношении пробы соляной кислоты и ацетона 4,0 4- 4.5:1.3 5-4,0 а раствор трилона Б использ ют с рН 4,5 - 4,8 Способ позволяет идентифицировать и определять остаточные количества антибиотиков из группы тетрациклина (тетрациклин окси- тетрациклин, метациклин и доксициклин)на уровне 0 0005% или 0.005 мг на 1 г меда LH