Способ определения концентрации белка Е вируса клещевого энцефалита в препаратах вакцины, сорбированных на гидроокиси алюминия Советский патент 1992 года по МПК G01N33/535 

Изобретение относится к области медицинской вирусологии, а именно к изучению способов стандартизации вакцин против клещевого энцефалита (КЭ), сорбированных на гидроокиси алюминия, по количеству измеряемого в них антигена (иммунногенного белка Е).

Целью изобретения является повышение чувствительное и определения сорбированного антигена.

Способ осуществляется следующим образом.

В лунках панели для постановки серологических реакций (или инсулиновых флаконах, пробирках) готовят трехкратные разведения исследуемого препарата на рабочем буфере (0,01 М фосфатный буфер рН 7,5. 0,13 М хлористый натрий, 10%-ная нормальная лошадиная сыворотка, 0 1%-ный твин 80) в объеме 200-400 мкл В эти же лунки вносят специфические антитела в объеме 100-200 мкл того же буфера в разведении, обеспечивающим 60%-ное максимальное связывание исследуемого антигена (оптимальная концентрация) Смесь инкубируют при 20-22°С в течение 23ч при постоянном перемешивании По окончании инкубации смесь выдерживают

XI

О OJ

со

15-20 мин без перемешивания для осаждения частиц гидроокиси алюминия (в случае использования для инкубации пробирок или флаконов этот этап можно ускорить центрифугированием при 1000 об/мин 3-5 мин). Надосадочную прозрачную жидкость, содержащую несвязавшиеся с исследуемым антигеном антитела, вносят в панель для ИФМ с сорбированным на ней стандартным антигеном (подложкой)- белком Е или инак- тивированным формалином вирусом КЭ. Формирование подложки в панели осуществляют путем инкубации стандартного антигена в концентрации 1-2 мкг/мл в 0,01 М фосфатном буфере рН 7,5 при 4°С в течение 17 ч (в течение ночи), или при 37°С в течение 1-2 ч. Количество связавшихся с подложкой специфических антител выявляют с помощью пероксидазного коньюгата антиви- довых антител. Количество вирусного антитела в исследуемом препарате рассчитывают по калибровочной кривой стандартного раствора антигена. .

Пример 1.В лунки панели для постановки реакции гемагглютинации (панель 1) вносят по 200 мкл рабочего буфера. Автоматической пипеткой объемом 100 мкл раститровывают в лунках исследуемый препарат инактивированной культуральной вакцины против КЭ, сорбированный на гидроокиси алюминия. В лунки с раститрован- ным образцом вносят в объеме 100 мкл рабочего буфера кроличьи антитела к белку Е в оптимальной концентрации. Панель укрепляют на вибраторе, устанавливают режим вибрации, не допуская выплескивания смеси из лунок, инкубируют при 20°С в течение 2 ч. В панель для ИФМ (панель 2) вносят по 100 мкл белка Е в 0,01 М фосфатном буфере рН 7,5 в концентрации 1 мкг/мл и инкубируют при 37°С 1-2 ч. Панель 1 снимают с вибратора, выдерживают 15 мин до осаждения гидроокиси алюминия. Панель 2 трижды отмывают отмывочным раствором (0,01 М фосфатный буфер рН 7,5. 0,13 М хлористый натрий; 0.05%-ный твин 80). По 100 мкл надосадочной прозрачной жидкости, не взмучивая осадка гидроокиси алюминия из панели 1 переносят в лунки панели 2, инкубируют 1 ч при 37°С. По окончании инкубации панель 2 отмывают, как указано, в лунки вносят по 100 мкл пероксидазного конъюгата антикроличьих антител в избыточной концентрации. Инкубируют 30 мин при 37°С. Панель трижды отмывают отмывочным раствором, затем однократно 0,01 М .фосфатным буфером

рН 7,5 без детергента.Вносятвлункипо 100 мкл раствора субстрата (4 мг ортофенилен- диамина в 10 мл ацетатного буфера рН 5,5 с 0,03%-ным На02). Реакцию останавливают через 20 мин добавлением в лунки по 50 мкл 5%-ной серной кислоты. Измерение оптической плотности проводят при 492 нм.

В предлагаемом способе сорбированный на гидроокиси алюминия антиген и специфические антитела взаимодействуют один с другим в растворе во взвешенном состоянии и, таким образом, частицы гидроокиси алюминия не оказывают неблагоприятное механическое воздействие на процесс образования иммунных комплексов, что происходит в известном способе, когда антитела фиксированы на поверхности панели. С этой же целью устранения

механического воздействия частиц гидроокиси алюминия на подложку стандартного антигена при измерении иммунофермент- ным методом количества не связавшихся с исследуемым антигеном антител последние предварительно отделяют от частиц гидроокиси алюминия и сорбированных на этих частицах иммунных комплексов. В результате предлагаемый способ позволяет в 40 раз .повысить чувствительность огфеделения антигена в сорбированных вакцинах по сравнению с известным способом и с одинаковой эффективностью определять антиген в вакцинах как до, так и после сорбирования их на гидроокиси алюминия.

Формула изобретения Способ определения .концентрации белка Е вируса клещевого энцефалита в препаратах вакцины, сорбированных на гидроокиси алюминия, включающий инкубацию сорбированного на гидроокиси алюминия вирусного антигена со специфическими антителами при постоянном перемешивании с последующим измерением количества не

связавшихся с антигеном антител иммуно- ферментным методом, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности способа, реакцию взаимодействия исследуемого антигена со специфическими

антителами осуществляют в растворе при концентрации специфических антител, обеспечивающей 50% максимальное связывание антигена, далее не связавшиеся с антигеном антитела отделяют в составе

надосадочной жидкости от частиц гидроокиси алюминия с последующим определением их концентрации.

Изобретение относится к иммунохими- ческим методам измерения содержания антигена в вакцинах против клещевого энцефалита (КЭ). Целью изобретения является повышение чувствительности определения. Количество вирусного антигена определяют иммуноферментным методом (ИФМ) в вакцинах против КЭ, сорбированных на гидроокиси алюминия. Реакцию взаимодействия исследуемого антигена со специфическими антителами проводят при 20-22°С в течение 2-3 ч при постоянном перемешивании в растворе при оптимальной концентрации антител. При этом процесс образования комплексов антиген - антитело происходит в растворе, а не на поверхности панели, тем самым устраняется возможное неблагоприятное механическое воздействие частиц гидроокиси алюминия на подложку антител и на процесс образования иммунных комплексов. С этой же целью для определения в ИФМ количества не связавшихся с антигеном антител их отделяют в составе надоса- дочной жидкости от частиц гидроокиси алюминия. Концентрацию белка Е в исследуемом препарате вакцины, обратно пропорциональную концентрации не связавшихся с антигеном антител, вычисляют по калибровочной кривой относительно стандартного образца белка Е. Положительный эффект изобретения заключается в повышении чувствительности способа в 40 раз. (Л С