ШТАММ У-ВИРУСА КАРТОФЕЛЯ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕНА, ИСПОЛЬЗУЕМОГО ПРИ ПРОИЗВОДСТВЕ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО ДИАГНОСТИКУМА Российский патент 1996 года по МПК C12N7/00 G01N33/531 

Изобретение относится к фитовирусологии, в частности к иммунодиагностике фитовирусов, и касается нового штамма Y-вируса картофеля (YBК).

Известны штаммы Y-вируса картофеля, отличающиеся по антигенной активности, на основе которых получены диагностическим сыворотки для серодиагностики YВК.

Известен также штамм Y-вируса картофеля, выделенный из растения картофеля сорта Белорусский ранний, относящийся к группе обычных штаммов YBK, иммунизацией препаратом которого получены антисыворотки с титром 1:4096 - 1: 8192 в тесте микропреципитации, на который получено авторское свидетельство, как на антигеноактивный штамм YВК.

Недостатком сывороток, полученных с помощью упомянутых штаммов YВК, является то, что для их получения использовались низкоочищенные антигены, что не позволяет рекомендовать их для получения антигеноактивных высокоочищенных препаратов при производстве иммуноферментых диагностикумов.

Целью изобретения является выделение нового штамма Y-вируса картофеля для получения высокоочищенных иммунологически активных препаратов с целью повышения качества иммуноферментных диагностикумов и эффективности выявления YВК.

Штамм YВК выделен из естественно зараженных растений картофеля сорта Лорх. Ему присвоен номер YВК-0-1Л, под которым он депонирован в коллекции штаммов вирусов картофеля НПО по картофелеводству.

Штамм характеризуется следующими свойствами.

Морфологические и физические свойства. Штамм YВК-0-1Л имеет нитевидные, содержащие одноцепочечную РНК частицы размером 730 • 11 нм. Точка температурной инактивации 54 + 1^oС, точка предельного разведения 10^-3. Инфекционные свойства в соке растений Nicotiana tabacum при 2^oС сохраняются 108 дней, а при 19^oС 2 дня.

Коэффициент седиментации равен 145 S, мол. масса белка вируса 32000 D, плавучая плотность вирионов 1,32 г/см³ в CsCl.

Круг восприимчивых растений. Штамм YВК-0-1Л на растениях картофеля сорта Лорх вызывает симптомы полосчатой мозаики. При заражении растений N.tabacum сорта Самсун NN вызывает системную крапчатость расплывчатого типа. На растениях физалиса Physalys florydana вызывает системный некроз стеблей и листьев. При инокуляции долей листьев индикаторных растений гибрида А6 (S.demissum х Аквила) и ТЕ-1 (S. chacoense) при температуре 22-24^oС и освещенности 10-12 тыс. люкс на 7 день появляются темно-коричневые локальные некрозы округлой формы.

Культивирование. Штамм YВК-0-1Л передается механическим путем с помощью карборунда на растения табака Nicotiana tabacum сорта Самсун NN, которые используются для накопления вирусного антигена. Вирус обнаруживается в листьях инфицированных растений методами капельной агглютинации и иммуноферментного анализа (ИФА) через 10-14 дней после заражения.

Характеристика антигена. Вирионы штамма YВК-0-1Л в растениях табака Nicotiana tabacum накапливаются в высокой концентрации, предельное разведение сока в DAS-ELISA варианте ИФА достигает 1:10 и более. Выход высокоочищенного препарата составляет 10-50 мкг/л листьев табака. Препараты характеризуются высокой степенью чистоты (А260/А280 1,21-1,25), отсутствием примесей белков растений-накопителей при исследовании препаратов методами SDS-электрофореза и иммуноблотинга, а также высокой антигенностью (минимальная выявляемая концентрация вируса в свежевыделенных препаратах менее 30 нг/мл). Высокоочищенные препараты хранились в 50% глицерине при -18^oС без заметного снижения антигенных свойств вируса после 12 месяцев хранения.

Условия хранения штамма. Штамм YВК-0-1Л поддерживают на растениях Nicotiana tabacum in vitro в стерильной культуре. Пробирочные растения периодически (через 1,5-2 мес. ) черенкуют и пересаживают на свежую питательную среду.

Сравнительное изучение штамма.

Сравнительное изучение патогенности штамма YВК-0-1Л проводили в отделе биотехнологии НПО по картофелеводству Российской сельскохозяйственной академии в 1985-1990 годах.

Патогенность штамма YВК-0-1Л по сравнению с 8 другими штаммами Y-вируса картофеля изучали на растениях картофеля Solanum tuberosum L. табака Nicotiana tabacum L. глютинозы Nicotiana glutinosa L. и физалиса Physalys floridana Rydb.

На основании полученных данных изучаемые штаммы были разделены на обычные YВК-0 (3 штамма), некротические YВК-N (4-штамма) и штриховатой полосчатости YВК-С (2-штамма). Штамм YВК-0-1Л отнесен нами к группе обычных штаммов Y-вируса картофеля. На растениях картофеля сорта Лорх вызывает симптомы полосчатой мозаики на второй год после заражения. Штаммы этой группы характеризуются суровыми симптомами на растениях Nicotiana glutinosa, Physalis floridana и характерными симптомами системной крапчатости на листьях Nicotiana tabacum. Для штаммов некротической группы характерны суровые симптомы системного некроза жилок Nicotiana tabacum, системная крапчатость на листьях Physalis floridana и очень мягкие симптомы крапчатости листьев почти на всех сортах картофеля. Для штаммов штриховатой полосчатости характерна реакция сверхчувствительности на многих сортах картофеля, а также характерные симптомы системной штриховатой полосчатости или мягкой мозаики на листьях Nicotiana tabacum.

Пример 1. Применение штамма YВК-0-1Л для получения антисыворотки.

Для накопления вируса с целью выделения вирусного антигена используют растения табака Самсун NN, иммунного к ВТМ, которые заражают инфекционным соком, содержащим штамм YВК-0-1Л, полученным из штаммовых растений табака.

Зараженные растения выращивают в изолированных условиях в теплице или пленочно-марлевом домике. За ними проводят уход, который заключается в поливе водопроводной водой и рыхлении почвы.

Максимальное накопление вируса наблюдается через 14-20 дней после заражения. Перед срезанием листьев все растения проверяют на наличие вируса и отсутствие других вирусов методом иммуноферментного анализа. Свежесрезанные листья охлаждают и гомогенизируют в блендоре в течение 2 мин с охлажденным 0,05 М фосфатным буфером рН 9,0, содержащим 0,005 М ЭДТА 0,2% 2-меркаптоэтанола в соотношении 2 мл буфера на 1 г листьев. Сок отжимают через марлю доводят рН до 7,8-8,0 1 М КОН и центрифугируют при 12000 об/мин. в течение 20 мин при 5^oС. Осадок отбрасывают, а к водной фазе добавляют Тритон-Х-100 до конечной концентрации 0,5% перемешивают по холоду 30 мин и осаждают вирус добавлением ПЭГ-6000 до конечной концентрации 5% и NaCl до 0,15 М. Смесь выдерживают 2 ч в холодильнике и центрифугируют в течение 20 мин при 12000 об/мин. Супернатант отбрасывают, а из осадка трижды экстрагируют вирус 0,3 М глициновым буфером рН 7,5, осветляя каждый раз раствор низкоскоростным центрифугированием при 10000 об/мин в течение 15 мин. Общий объем экстракта должен составлять 1/10 исходного объема сока. Далее экстракт наносят на сахарозную подушку (250 мг/мл сахарозы в 0,05 М глициновом буфере рН 7,5, 15% от объема пробирки) и центрифугируют при 130000 g 2,5 ч при 12^oС в бакет-роторе ультрацентрифуги. Конечный препарат получают экстрагированием вируса из материала, прошедшего через сахарозную подушку, 0,05 М глициновым буфером с последующим низкоскоростным центрифугированием в течение 15 мин при 1000 об/мин. В полученных препаратах YВК определялась концентрация и чистота спектрофотометрически по светопоглощающей при А260 и А280, используя коэффициент А260 2,65 с поправкой на светорассеяние препарата и соотношение А260/А280 1,21 1,25 для высокоочищенных препаратов. Высокая чистота полученных препаратов подтверждена также методами электронной микроскопии, SDS-электрофореза и иммуноблотинга. Препараты консервировали глицерином до 50% и хранили при -18^oС.

Иммунизацию кроликов проводили четырьмя штаммами YВК YВК-0-1Л, YВК-0-Б, YВК-N-Б (выделены в Белоруссии), YВК-N-D884 (выделен в Германии) по схеме состоящей из трех комбинированных внутрикожных и подкожных инъекций в дозе 100-200 мкг вируса на инъекцию с полным и неполным адъювантом Фрейнда через интервалы 15-20 дней. Кровь отбирали через 7-9 дней после последней инъекции.

Полученные моноштаммовые антисыворотки характеризовались специфическим и неспецифическим титром в непрямом варианте ИФА. Выделенные из антисывороток с помощью хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе и высаливания сульфатом аммония специфические антитела и полученные из них конъюгаты с высокоочищенной пероксидазой хрена также характеризовались чувствительностью определения высокоочищенного вируса в DAS-ELISA и степенью антигенного родства штаммов в PAS-ELISA вариантах ИФА (таблица).

Данные таблицы показывают, что иммунизация кроликов антигеном штамма YВК-0-1Л позволила получить антисыворотку, имеющую наибольший специфический и наименьший неспецифические титры по сравнению с антигенами других штаммов, имеющую широкий спектр антигенного родства, что дает возможность получать иммуноферментные диагностикумы более высокого качества.

Пример 2. Получение иммуноферментного диагностикума на основе антисыворотки, полученной к штамму YВК-0-1Л.

Нативную антисыворотку, полученную иммунизацией кроликов штамма YВК-0-1Л, разводили в 4 раза 0,01 М фосфатным буфером рН 8,0 и наносили на активированную и уравновешенную этим же буфером колонку, заполненную DEAE-Сервацелом DE-52 в соотношении 5 г сухого сорбента на 10 мл нативной сыворотки и элюировали несорбированные белки буфером до получения значения А280 меньше 0,05. Несорбированную фракцию осаждали дважды при 40% насыщения сульфатом аммония и центрифугировали осадок 15 мин при 10000 об/мин. Определяли содержание белка спектрофотометрически по поглощению при 280 нм и чистоту глобулиновой фракции по соотношению А280/А252. Для высокоочищенных препаратов иммуноглобулинов это соотношение должно быть 2,3-2,6. Далее часть иммуноглобулинов замораживали или лиофильно высушивали и использовали как покровные антитела, а другую часть конъюгировали с высокоочищенной пероксидазой хрена методом периодатного окисления.

Проведенные испытания иммунодиагностикумов, полученных из антисывороток, приготовленных к разным штаммам YВК показали, что наибольшей чувствительностью определения YВК в очищенных препаратах (3 нг/мл) обладали иммунодиагностикумы, полученные с помощью антисыворотки, полученной к штамму YВК-0-1Л. Иммунодиагностикум, полученный на основе штамма YВК-0-1Л перекрестно реагировал с 8 другими штаммами YВК, относящимися к трем основным штаммовым группам с чувствительностью, превосходящей чувствительность диагностикумов, полученных к другим штаммам, и не давал положительной реакции с соками здоровых растений картофеля и табака.

Таким образом, использование штамма YВК-0-1Л позволяет получать высокоочищенные препараты YВК с высоким выходом вируса, стабильные в течение длительного времени при хранении, иммунизация которыми позволяет получать высококачественные антисыворотки, пригодные для приготовления иммуноферментных диагностикумов высокого качества. ТТТ1

Использование: фитовирусология, в частности иммунодиагностика вирусов растений. Касается нового штамма Y- вируса картофеля. Сущность изобретения: Штамм выделен из естественно зараженных растений картофеля сорта Лорх. Ему присвоен шифр YВК-0-1Л. Он депонирован в коллекции НПФ Биотехцентр под N 1. Титр антисыворотки, полученной иммунизацией штаммов YВК-0-1-Л составил 1: 819200, а с помощью ранее известных штаммов YВК 1:102400-1:409600 в непрямом варианте ИФА, а чувствительность диагностикумов, приготовленных из моноштаммовых антисывороток соответственно 3 и 7-30 нг/мл вируса. Штамм YВК-0-1Л характеризуется высоким выходом вируса при очистке, стабильностью при длительном хранении и позволяет получать высокоспецифичные антисыворотки для приготовления иммуноферментных диагностикумов. 1 табл.

Штамм У-вируса картофеля НПФ "Биотехцентр" 1 для получения антигена, используемого при производстве иммуноферментного диагностикума.