Штамм "Рич" вируса коронавирусного энтерита собак для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики коронавирусного энтерита собак Российский патент 2023 года по МПК C12N7/00 

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии, может быть использовано для разработки и изготовления средств диагностики и специфической профилактики коронавирусного энтерита собак.

Коронавирусный энтерит собак - контагиозное вирусное заболевание, характеризующееся геморрагическим воспалением желудочно-кишечного тракта, обезвоживанием и общим истощением организма [1]. Возбудитель (CCoV - Canine Coronavirus) заболевания Alphacoronavirus-1, относится к семейству Coronaviridae, роду Alphacoronavirus, широко распространен в популяции собак, в основном в питомниках и приютах для животных. Коронавирус очень инвазивен и быстро распространяется в группах собак. Вирус выделяется с фекалиями инфицированных животных недели и даже месяцы, и контаминированная внешняя среда является главным фактором распространения инфекции [1]. По данным ФГБУ «Центр ветеринарии» МСХ РФ за 2017-2019 гг. коронавирусный энтерит собак занимает третье место по случаям заболеваемости собак в Российской Федерации (21%), а по некоторым литературным данным второе место в мире среди энтеропатогенов после парвовирусного энтерита [2, 3, 4]. Долгое время коронавирусный энтерит собак рассматривали как легкую инфекцию, поражающую в основном щенков в возрасте до 5 мес. Летальный исход отмечался только в случае смешанных инфекций. Однако исследования по молекулярной эпизоотологии, проведенные в Италии и Австралии, позволяют утверждать, что вирус меняется, и его вирулентность постепенно растет [5]. В связи с этим встает вопрос о необходимости разработки средств вакцинопрофилактики, обеспечивающих надежную защиту от новых штаммов коронавирусного энтерита собак.

В настоящее время известны следующие производственные штаммы вируса коронавирусного энтерита собак, которые применяются для изготовления средств специфической профилактики против данного заболевания:

- штамм «NL-18» [6];

- штамм «TN 449» [7];

- штамм «Карат» [8];

- штамм «№49» [1,9].

Штаммы «NL-18» и «TN 449» входят в состав импортных ассоциированных вакцин против инфекционных болезней собак, однако, на территории РФ данные импортные препараты имеют высокую стоимость.

Штамм «Карат» для производства вакцины репродуцируется в первично-трипсинизированной культуре клеток почки щенка, что влечет за собой постоянную потребность в органах животных для изготовления вакцины.

Наиболее близким предполагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является штамм «№49» коронавирусного энтерита собак, используемый для изготовления отечественной ассоциированной вакцины «Мультикан».

Однако предлагаемый штамм «Рич» вируса коронавирусного энтерита собак на сегодняшний день является единственным известным штаммом коронавирусного энтерита собак на территории России, для которого определена полногеномная нуклеотидная последовательность. Учитывая зарубежный опыт, официально опубликованы 3 референтные полногеномные последовательности кДНК вируса коронавирусного энтерита собак, а именно CCoV СВ/05 (размер генома - 29 278 п.н.), CCoV NTU336/F/2008 (размер генома - 29 363 п.н.), CCoV-HuPn-2018 (размер генома - 29 088 п.н.), однако они принадлежат генотипу CCoV2. Для последующего анализа преимущественно использовали нуклеотидные последовательности Alphacoronavirus - 1 различных штаммов.

CCoV имеет два разных генотипа: I и II. Альфакоронавирус-1 включает виды типа хозяина собачьего коронавируса (CCoV), кошачьего коронавируса (FCoV), вируса трансмиссивного гастроэнтерита (TGEV) и респираторного вируса свиней (PRCoV). Тип CCoV-II разделен на подтипы CCoV-IIa (классические штаммы) и CCoV-IIb (TGEV-подобные штаммы), с предполагаемой рекомбинацией между штаммами CCoV-II и TGEV. Кроме того, в последнее десятилетие появился один уникальный подтип, относящийся к CCoV-IIa; этот подтип считается пантропным, поскольку он может вызывать кишечные и системные симптомы, о которых сообщалось в Бельгии, Бразилии, Франции, Греции, Венгрии, Ирландии, Италии, Румынии и на карибском острове Сент-Китс.

Известны также два генотипа FCoV: FCoV-I и FCoV-II. Предполагалось, что CCoV и FCoV типа I произошли от общего наследственного вируса, в то время как штаммы CCoV и FCoV типа II возникли в результате множественных событий рекомбинации. FCoV может быть обнаружен как легкий кишечный коронавирус кошек FCoV и как высоковирулентный вирус перитонита кошек (FIPV).

Задача, на решение которой направлено настоящее изобретение, заключается в расширении арсенала производственных штаммов вируса коронавирусного энтерита собак, обладающих новыми биологическими и генетическими характеристиками, и пригодных для изготовления средств диагностики и специфической профилактики данного заболевания. Указанная задача решена в результате депонирования нового штамма «Рич» вируса коронавирусного энтерита собак, который может быть использован для проведения лабораторных исследований и изготовления средств вакцинопрофилактики.

Изолят вируса коронавирусного энтерита собак, послуживший источником для получения штамма «Рич» был выделен из патологического материала, полученного от погибшего беспородного щенка, содержащегося в ВООО Центра животных «Валента» на территории г. Владимир, в 2021 г.

Штамм «Рич» вируса коронавирусного энтерита собак депонирован во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вируса ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ», под регистрационным номером: №376 - деп/22-10 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ.

Экспериментально подтверждена возможность использования штамма «Рич» вируса коронавирусного энтерита собак для изготовления средств диагностики и профилактики данного заболевания.

Для получения штамма «Рич» вируса коронавирусного энтерита собак, обладающего оптимальными биотехнологическими свойствами, использовали первично-трипсинизированную культуру клеток селезенки котенка (СК). В результате проведения серии последовательных пассажей на данной культуре клеток и перевиваемой культуре клеток почки кошки (CRFK) из ранее выделенного изолята был получен штамм «Рич» вируса коронавирусного энтерита собак, имеющий стабильные биотехнологические свойства и пригодный для использования при проведении лабораторных исследований и изготовления диагностических препаратов и препаратов специфической профилактики данного заболевания. Штамм адаптирован к перевиваемой культуре клеток почки кошки (CRFK), что позволяет в промышленных масштабах получать вирусный материал штамма «Рич» вируса коронавирусного энтерита собак с титрами инфекционной активности от 3,0 до 3,5 lg ТЦД₅₀/см³.

Идентификация и филогенетическое родство штамма «Рич»

Проводили генетическую идентификацию полученного вируса и сравнительный анализ последовательности к ДНК. Использовали обратную транскрипцию и полимеразную цепную реакцию (ОТ-ПЦР). Для идентификации и филогенетического анализа осуществляли секвенирование.

Редактор выравнивания последовательностей BioEdit использовался для анализа необработанных последовательностей. Выравнивания, содержащие полногеномные последовательности, были построены с использованием программы Clustal_W. Эволюционная история была выведена с использованием критерия максимального правдоподобия, основанного на 3-параметрической классической модели Tamura. Дерево было нарисовано в масштабе, с длиной ветвей, измеренной в количестве замен на сайт. Эволюционный анализ был проведен в MEGA7. Выравнивание аминокислотных последовательностей проводили с использованием Clustal X.

Дендрограмма основана на сравнении полных нуклеотидных последовательностей М-гена кДНК вируса коронавирусного энтерита собак.

Сущность изобретения отражена на графических изображениях:

Фиг. 1 - Фотография вирионов вируса коронавирусного энтерита собак штамма «Рич» по данным электронной микроскопии.

Фиг. 2 - Филогенетическое древо для вируса коронавирусного энтерита собак штамма «Рич».

Фиг. 3 - Состояние монослоя клеточной линии почки кошки (CRFK) до (А) и после (Б) репродукции вируса коронавирусного энтерита собак штамма «Рич».

Сущность изобретения пояснена в перечне последовательностей, в котором:

SEQ ID NO: 1 представляет последовательность нуклеотидов М-гена кДНК вируса коронавирусного энтерита собак производственного штамма РИЧ;

SEQ ID NO: 2 представляет последовательность аминокислот М-гена кДНК вируса коронавирусного энтерита собак производственного штамма РИЧ.

Штамм «Рич» вируса коронавирусного энтерита собак характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологические признаки

Штамм «Рич» вируса коронавирусного энтерита собак относится к семейству Coronaviridae, подсемейству Orthocoronavirinae, роду Alphacoronavirus, виду Alphacoronavirus-1 и обладает морфологическими признаками, характерными для представителей коронавирусов: вирионы сферической формы, нуклеокапсид окружен белковой мембраной и липосодержащей внешней оболочкой, от которой отходят шиловидные отростки. Фотография вирионов вируса коронавирусного энтерита собак штамма «Рич» по данным электронной микроскопии представлена на фиг. 1.

Антигенные свойства

В антигеном отношении вирус коронавирусного энтерита собак родственен вирусам трансмиссивного гастроэнтерита свиней и коронавирусу кошек [1]. У переболевших животных в сыворотках крови образуются антитела, выявляемые в реакции нейтрализации (РН). Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой в РН в культуре клеток CRFK. Инокуляция в организм животного штамма «Рич» вируса коронавирусного энтерита собак сопровождается образованием вируснейтрализующих антител в крови в титре от 3,1 log₂ SN₅₀ до 6,9 log₂ SN₅₀ у кроликов и от 2,8 log₂ SN₅₀ до 5,1 log₂ SN₅₀ у хорьков.

Устойчивость к внешним факторам

Вирус не устойчив во внешней среде. На поверхностях при температуре (24±2)°С погибает в течение 48 ч. В кале собак сохраняется не более 2 суток. Относительно стабилен в кислой среде при рН 6,0-6,5. Чувствителен к формальдегиду, глутаровому альдегиду, 70% раствору этилового спирта, четвертичным аммонийным соединениям. Переносит двукратное размораживание и оттаивание.

Дополнительные признаки и свойства:

Реактогенность - реактогенными свойствами не обладает.

Патогенность - низкопатогенен для естественно-восприимчивых животных.

Вирулентность - слабовирулентен для естественно-восприимчивых животных при внутрибрюшинном заражении.

Безвреден для кроликов и белых мышей при внутримышечном и подкожном заражении.

Стабильность - сохраняет исходные биологические свойства при пассировании в чувствительных биологических системах в течение 5 пассажей (срок наблюдения) на перевиваемой культуре клеток CRFK.

Контаминация бактериями, грибами, микоплазмами и посторонними вирусами - штамм «Рич» не контаминирован бактериями, грибами, микоплазмами и посторонними вирусами.

Условия хранения

При хранении штамма в нативном состоянии при температуре -70±5°С допустимая длительность хранения без освежения составляет 12 мес, а при хранении в лиофилизированном состоянии при той же температуре - 10 лет.

Биотехнологические характеристики

Штамм «Рич» вируса коронавирусного энтерита собак репродуцируется в перевиваемой культуре клеток почки кошки (CRFK) и в перевиваемой культуре клеток селезенки кошки (FS), а также в первично-трипсинизированной культуре клеток селезенки котенка (СК). Репродукция вируса в культуре клеток FS и СК не сопровождается специфическим цитопатическим действием. Репродукция вируса в культуре клеток CRFK сопровождается специфическим цитопатическим действием, приводящим к образованию симпластов и деструкции монослоя через 48-72 ч культивирования. Биологические свойства характеризовали путем определения инфекционной активности вируса каждого пассажа в перевиваемой культуре клеток CRFK и на естественно восприимчивых животных - 2-4 месячных щенках собак. При культивировании вирус штамма «Рич» накапливается в титре не менее 3,0 lg ТЦД₅₀/см³ и сохраняет исходные характеристики при пассировании в чувствительных биологических системах в течение не менее 5 пассажей (срок наблюдения).

Гено- и хемотаксономическая характеристики

Штамм «Рич» вируса коронавирусного энтерита является РНК-содержащим вирусом и размером около 29,4 kb. Около 2/3 геномной РНК вируса занимают две большие, частично перекрывающиеся открытые рамки считывания (ORF), ORF1a и ORF1b, которые кодируют два полипротеина (репликазные белки), приводящих к образованию вирусной репликазы. ORF 1а и 1ab, кодирующими 16 неструктурных белков, которые генерируют репликазный комплекс. С 3'-конца 1/3 генома (примерно 9000 н.о.) состоит из других ORF, кодирующих структурные и неструктурные белки. Структурные белки включают белки S, Е, М и N, кодируемые ORF2, ORF4, ORF5 и ORE6 соответственно.

Пять основных генов кодируют следующие белки: шипообразный белок (S-белок), мембранный гликопротеин (М-белок), нуклеокапсид (N-белок), белок оболочки (Е-белок) и ORFlab (большой полипротеин, известный как репликаза / протеаза). М-белок - мембранный белок с тройным охватом, который является наиболее распространенным белком в вирионе. Он играет центральную роль в сборке и морфогенезе вирионов, а также определяет форму вирусной оболочки. Данный белок рассматривается как центральный организатор сборки вирусной частицы, взаимодействующий со всеми другими основными структурными белками коронавируса. Взаимодействия между М-белками являются основной движущей силой формирования оболочки вириона. Кроме того, для полного формирования вириона ему необходимо взаимодействовать с другими структурными белками коронавируса. Взаимодействие спайкового S-белка с М-белком не требуется для процесса сборки. Однако связывание М-протиена с N-белком стабилизирует нуклеокапсид (комплекс N-белок-РНК), а также внутреннее ядро вирионов и, таким образом, способствует завершению сборки вируса.

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его использования, которые не ограничивают объем изобретения.

Пример 1. Биологические и вирусологические исследования штамма «Рич» вируса коронавирусного энтерита.

Биологические и вирусологические методы включали адаптацию вируса, выделенного из патологического материала, полученного от погибшего щенка, к культурам клеток CRFK, FS и СК. Для выделения вируса, вирусную суспензию вносили на освобожденный от ростовой среды монослой первично-трипсинизированной культуры клеток селезенки котенка (СК) и экспонировали в течение 60 мин при температуре (37,0±0,5)°С. Затем вносили поддерживающую среду ПСС (или аналог) с добавлением 2% фетальной сыворотки крови КРС и антибиотиков (стрептомицин 100 мкг/см³ и пенициллин 100 ЕД/см³). Инфицированную культуру инкубировали при температуре (37,0±0,5)°С в течение 72 ч, затем замораживали при минус (45,0±5,0)°С. Полученный вируссодержащий материал использовали для последующих пассажей. После проведения трех «слепых» пассажей в первично-трипсинизированной культуре клеток СК, вируссодержащий материал вносили на освобожденный от ростовой среды монослой перевиваемых культур клеток почки кошки (CRFK), селезенки кошки (FS) и инкубировали в течение 60 мин при температуре (37,0±0,5)°С. Затем вносили поддерживающую среду ПСС (или аналог) с добавлением 2% фетальной сыворотки крови КРС и антибиотиков (стрептомицин 100 мкг/см³ и пенициллин 100 ЕД/см³). Инфицированную культуру инкубировали при температуре (37,0±0,5)°С в течение 72 ч (культура клеток FS) или до появления цитопатического действия (ГДПД) вируса (только в культуре клеток CRFK), которое характеризовалось округлением клеток, истончением цитоплазмы отростков клеток, образованием симпластов и, в дальнейшем, тотальной деструкцией и отслоением монослоя клеток от субстрата. Клеточный монослой до действия вируса представлен на фиг. 3А, после формирования ГДПД - на фиг. 3Б. При поражении не менее 70-80% площади монослоя (округление, отслоение от стекла, образование симпластов) культуральные флаконы промораживали при температуре минус (45,0±5,0)°С и после оттаивания при комнатной температуре производили сбор вируса с последующим отбором проб для исключения микробной контаминации и определения инфекционной активности вируса методом титрования в культуре клеток CRFK. Титрование вируса проводилось в соответствии с «Методическими рекомендациями по титрованию вируса коронавирусного энтерита собак микрометодом» [10]. Результаты адаптации вируса к различным клеточным культурам представлены в таблице 1. Инфекционная активность вируса в культуре клеток CRFK составила 3,5±0,14 lg ТЦД₅₀/см³, в культуре клеток FS 3,0±0,14 lg ТЦД₅₀/см³, в первично-трипсинизированной культуре клеток СК 3,30±0,14 lg ТЦД₅₀/см³. Данные, приведенные в таблице 1, свидетельствовали о хорошей адаптационной активности штамма «Рич» вируса коронавирусного энтерита собак к данным клеточным культурам. Первое проявление ЦПД вируса в культуре клеток CRFK наблюдается через 48 ч культивирования. Через 72 ч культивирования большая часть клеток отслаивалась от субстрата, собиралась в агрегаты разного размера, часть клеток деградировала до детрита.

Пример 2. Контроль стабильности биологической активности штамма «Рич» вируса коронавирусного энтерита.

Контроль стабильности биологической активности штамма определяли в течение 5 последовательных пассажей в культурах клеток CRFK, FS и СК. Результаты изучения стабильности штамма по его биологической активности в течение 5 пассажей представлены в таблице 2. В ходе проведенных исследований установлено, что штамм «Рич» вируса коронавирусного энтерита собак в течение 5 последовательных пассажей в культурах клеток CRFK, FS и СК проявлял стабильную биологическую активность, которая находилась в пределах 3,5±0,14 lg ТДЦ₅₀/см³, 3,00±0,14 lg ТДЦ₅₀/см³ и 3,30±0,14 lg ТДЦ₅₀/см³, соответственно.

Пример 3. Получение антигена вируса коронавирусного энтерита собак штамма «Рич» вируса коронавирусного энтерита.

Для приготовления антигена в двухсуточную культуру клеток CRFK, выращенную в культуральных флаконах с площадью рабочей поверхности 300 см², предварительно слив с них ростовую среду, вносили вируссодержащий материал в дозе 0,01 ТЦД₅₀/кл. Флаконы помещали на один час в термостат при температуре (37,0±0,5)°С для контакта клеток культуры с вирусом. После этого вносили поддерживающую среду ПСС (или аналог) с добавлением 2% сыворотки крови КРС. Инфицированную культуру инкубировали при (37,0±0,5)°С до появления ЦПД вируса. При поражении площади монослоя не менее 70-80% культуральные флаконы подвергали замораживанию при температуре минус (45,0±0,5)°С. Стерильный инфицированный монослой дезагрегировали с рабочей поверхности флаконов путем его разморозки при температуре (20±2)°С и периодического встряхивания. По окончании разморозки интенсивным встряхиванием остатки монослоя удаляли с рабочей поверхности, затем соблюдая условия асептики, инфицированную суспензию собирали в общую емкость. Из собранного материала отбирали пробу для контроля. Контроль посевного материала штамма «Рич» вируса коронавирусного энтерита собак перед лиофилизацией осуществляли по показателю отсутствия контаминации грибами, бактериями и микоплазмами. Контроль контаминации грибами и бактериями посевного материала штамма «Рич» вируса коронавирусного энтерита собак проводили по ГОСТ 28085 [11]. Контроль контаминации микоплазмами осуществляли в соответствии с требованиями ГФ XIV, том II, с. 2997-3008 (ОФС.1.7.2.0031.15) [12]. Вируссодержащий материал с активностью не ниже 3,0 lg ТЦД₅₀/см^± хранили при температуре не выше минус (20±2)°С и использовали для изготовления вакцинных и диагностических препаратов.

Пример 4. Получение гипериммунной сыворотки против антигена вируса коронавирусного энтерита штамма «Рич».

Штамм «Рич» вируса коронавирусного энтерита использовали для получения высокоактивной гипериммунной сыворотки, предназначенной для оценки иммунобиологических свойств вируса коронавирусного энтерита собак. Для гипериммунизации животных применяли антиген вируса коронавирусного энтерита штамма «Рич», полученный по методике, указанной в примере 3. Кроликов иммунизировали в дозе 1,0 см³ внутримышечно по следующей схеме: 1) однократно, с обескровливанием через 35 дней после иммунизации; 2) двукратно с интервалом раз в 21 день, отбор крови на 21 сутки после второй иммунизации. Полученную сыворотку крови исследовали на наличие антител против антигена вируса коронавирусного энтерита штамма «Рич». Титр антител определяли в реакции микронейтрализации (РМН). Данные, представленные в таблице 3, свидетельствуют, что способом, описанным в примере 4, получены диагностические сыворотки со специфической активностью 4,08-6,92 log₂ SN₅₀ в РМН.

Пример 5. Изучение антигенной активности штамма «Рич» вируса коронавирусного энтерита собак на кроликах и хорьках.

Для изучения антигенной активности штамма «Рич» вируса коронавирусного энтерита собак использовали вируссодержащий материал с биологической активностью равной 3,5 lg ТЦД₅₀/см³, определенной до инактивации. Инактивацию проводили с помощью водного раствора бета-пропиолактона. Подопытным кроликам в количестве 5 голов вводили инактивированный материал в среднюю часть бедра в дозе 1,0 см³ двукратно с интервалом 21 сутки. Кроликов в количестве 5 голов оставили в качестве контроля. Титр антител к антигену вируса коронавирусного энтерита собак в сыворотках крови кроликов определяли через 14 суток после второй иммунизации в РМН по общепринятой методике.

Подопытным хорькам в количестве 10 голов вводили инактивированный материал внутримышечно в среднюю часть бедра в дозе 1,0 см³ двукратно с интервалом 21 сутки. 5 голов хорьков оставили в качестве контрольной группы. Титр антител к антигену вируса коронавирусного энтерита собак в сыворотках крови хорьков определяли через 14 суток после второй иммунизации в РМН по общепринятой методике.

Результаты исследований антигенной активности штамма «Рич» вируса коронавирусного энтерита собак представлены в таблице 4, из которой следует, что титр антител у иммунизированных кроликов составил 5,35±0,86 log₂ SN₅₀, у хорьков - 4,40±0,52 log₂ SN₅₀.

Пример 6. Изучение биологических свойств штамма «Рич» вируса коронавирусного энтерита собак (определение патогенности для собак).

Патогенность штамма «Рич» вируса коронавирусного энтерита собак изучали на естественно восприимчивых животных (беспородные щенки в возрасте 2-3 мес). Животных разделили на две группы по 4 головы в каждой - подопытную и контрольную. Подопытным щенкам вводили внутрибрюшинно вируссодержащую культуральную жидкость в объеме 3,0 см³ с титром инфекционной активности 3,5 lg ТЦД₅₀/см³. Животным контрольной группы вводили внутрибрюшинно 0,9% раствор хлорида натрия в объеме 3,0 см³. На 4 сутки после заражения у животных подопытной группы наблюдали характерные клинические признаки коронавирусного энтерита собак: снижение активности, отказ от корма, диарея, болезненность брюшной стенки. На 7 сутки один щенок (1/4) погиб. Специфичность заболевания животных подтверждена исследованиями биоматериала посредством диагностического набора ИФА (производство Ingenasa, Испания).

Пример 7. Изготовление вакцины против коронавирусного энтерита собак из штамма «Рич» и исследование ее эффективности.

По окончании цикла репродукции вируса коронавирусного энтерита собак штамма «Рич», не прекращая процесс термостатирования, в вируссодержащую суспензию добавляли 15%-ный раствор аминоэтилэтиленимина (АЭЭИ), подкисленный ледяной уксусной кислотой, корректируя рН до 8,2-8,6. Конечная концентрация АЭЭИ в вируссодержащей суспензии должна быть равной 0,05%. Инактивацию инфекционности вируса коронавирусного энтерита собак штамма «Рич» проводили в течение 12 часов при температуре 36-37°С и рН 7,2-7,6 с перемешиванием.

Спустя 12 ч антиген проверяли на наличие инфекционной активности вируса в монослойной культуре клеток CRFK. По результатам анализа в клеточной линии антиген вируса коронавирусного энтерита собак штамма «Рич» был полностью инактивирован.

Культуральную инактивированною суспензию антигена концентрировали в 30 раз с помощью полиэтиленгликоля (ПЭГ-6000) с концентрацией 50% к антигену в соотношении 1:4, с экспозицией 12 ч.

Для изготовления моновалентной эмульсионной вакцины из штамма «Рич» вируса коронавирусного энтерита собак в качестве адъюванта был выбран Montanide ISA-206 VG («Seppic», Р. Франция). При изготовлении вакцины использовали соотношение 50:50 по массе антигена и адъюванта.

Из полученной инактивированной вакцины был приготовлен ряд разведений для собак с 5-х кратным шагом. Беспородных собак разделили на 3 группы по 5 голов в каждой. Иммунизирующая доза составляла 1,0 см³. Первую группу животных (№№1-5) иммунизировали вакциной без разведения, вторую (№№6-10) привили вакциной, разведенной 1/5, третью (№№11-15) - вакциной, разведенной 1/25. Препарат вводили внутримышечно. 2 головы собак без вакцинации оставили в качестве контроля вируса.

Спустя 21 сутки после иммунизации от животных отбирали кровь, и полученные сыворотки анализировали в реакции нейтрализации (РН) с целью определения количества вируснейтрализующих антител (ВНА) в монослойной клеточной линии CRFK. Титры антител от иммунизированных животных указаны в таблице 5.

В таблице 5 продемонстрировано, что у собак, иммунизированных против вируса коронавирусного энтерита собак штамма «Рич» вакциной без разведения, среднее значение титра антител на 21 сутки против гомологичного штамма для пяти животных составило 6,20±0,21 log₂ SN₅₀, в результате введения вакцины в разведении 1/5 - 5,25±0,35 log2 SN₅₀, 1/25 - 3,65±0,14 log₂ SN₅₀. В сыворотках крови двух контрольных животных антитела против вируса коронавирусного энтерита собак штамма «Рич» не обнаружены.

Собак, иммунизированных в количестве по 15 голов, заражали контрольным штаммом «Рич» вируса коронавирусного энтерита собак, адаптированного к этим животным в дозе 10^4,0 ИД₅₀/0,20 см³. Спустя 4 суток (инкубационный период 1-4 суток) после заражения всех животных диагностировали в ОТ-ПЦР-РВ и оценивали состояние здоровья. Результаты контрольного заражения представлены в таблице 5, из которой следует, что вакцина из штамма «Рич», введенная в однократной дозе (1,0 см³) и в разведении 1/5 защищала всех собак (пять из пяти) от заражения гомологичным штаммом. Препарат, инокулированный в разведении 1/25, защитил 3 из 5 животных. Иммуногенную дозу (ИмД₅₀) рассчитывали по формуле Кербера:

где Д - доза вакцины,

d - шаг разведения,

I - количество защищенных животных,

N - количество зараженных животных, испытанных для одного разведения.

Количество протективных доз (ПД50) рассчитывали по формуле:

ПД₅₀ = прививная доза / ИМД₅₀

По результатам контрольного заражения было установлено, что в прививном объеме данной вакцины содержится 29,365 ПД₅₀ для собак.

В результате анализа подтвердили эффективность изготовленного вакцинного препарата из штамма «Рич» антигена вируса коронавирусного энтерита собак и возможность применения данного штамма для специфической профилактики животных от данного заболевания.

Таким образом, штамм «Рич» вируса коронавирусного энтерита собак, полученный в соответствии с предлагаемым изобретением, пригоден для изготовления инактивированных вакцин и диагностических целей, и расширяет арсенал новых отечественных производственных штаммов вируса коронавирусного энтерита собак.

Источники информации

1. Алипер Т.И., Непоклонов Е.А., Мухин А.Н. и др. Диагностика и профилактика инфекционных болезней собак и кошек: руководство для практикующих ветеринарных врачей. Под ред. Т.И. Алипера. М.: ЗооВетКнига; 2017. 300 с.

2. Alves CDBT, Granados OFO, Budaszewski RDF, Streck AF, Weber MN, Cibulski SP, Pinto LD, Ikuta N, Canal CW. Identification of enteric viruses circulating in a dog population with low vaccine coverage. Braz J Microbiol. 2018 Oct-Dec; 49(4):790-794. Doi: 10.1016/j.bjm.2018.02.006. Epub 2018 Mar 15. PMID: 29588198; PMCID: PMC6175709.

3. McElligott S, Collins PJ, Sleator RD, Martella V, Decaro N, Buonavoglia C, O'Shea H. Detection and genetic characterization of canine parvoviruses and coronaviruses in southern Ireland. Arch Virol. 2011 Mar; 156(3):495-503. Doi: 10.1007/s00705-010-0861-3. Epub 2010 Nov 24. PMID: 21107617; PMCID: PMC7087027.

4. Decaro N, Desario C, Billi M, Man V, Elia G, Cavalli A, Martella V, Buonavoglia C. Western European epidemiological survey for parvovirus and coronavirus infections in dogs. Vet J. 2011 Feb; 187(2): 195-9. Doi: 10.1016/j.tvj1.2009.10.027. Epub 2009 Nov 25. PMID: 19932978; PMCID: PMC7110566.

5. Pratelli A, Elia G, Martella A, et al.: 2002, M gene evolution of canine coronavirus in naturally infected dogs. Vet Rec 151: 758-761.

6. Вангард Плюс 5 L4 CV. - URL: https://www.vetlek.ru/ (дата обращения 30.06.22 г.).

7. Дюрамун Макс 5-CVK/4L. - URL: https://www.vetlek.ru/ (дата обращения 30.06.22 г.).

8. Пат. 2211705 Российская Федерация, МПК А61К 39/215(2006.01), C12N 7/00(2006.01). Вакцина против коронавирусного энтерита собак [Текст]/ Ольшанская А.А., Уласов В.И., Сазонкин В.Н.; заявитель и патентообладатель ФГБУ «ВГНКИ». - №2001134539/13; заявл. 2001.12.21; опубл. 2003.09.10.

9. Мухин А.Н., Остапчук О.В., Лосич М.А., Непоклонова И.В., Верховский О.А., Концевая Н.Н., Алипер Т.П. Антигенная активность усовершенствованной вакцины против чумы, аденовирусных инфекций, парвовирусного и коронавирусного энтерита, лептоспироза и бешенства собак Мультикан-8 [Текст]/ Мухин А.Н., Остапчук О.В., Лосич М.А., Непоклонова И.В., Верховский О. А., Концевая Н.Н., Алипер Т.П. // Ветеринария. - 2021. - №3. - 8-13. DOI: 10.30896/0042-4846.2021.24.3.08-14.

10.4. Методические рекомендации по титрованию вируса коронавирусного энтерита собак микрометодом / А.А. Комарова, Т.С. Галкина, A.M. Киселев, А.А. Климова; ФГБУ «ВНИИЗЖ». - Владимир: 2022 - 10 с.

11. ГОСТ 28085-13 «Средства лекарственные биологические для ветеринарного применения. Метод бактериологического контроля стерильности».

12. ГФ XIV, т. 2, с. 2997-3008. Испытания на присутствие микоплазм (ОФС.1.7.2.0031.15).

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="Canine

coronavirus.xml" softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="2.1.2"

productionDate="2022-09-09">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>2022121294</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2022-08-03</FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantFileReference>1</ApplicantFileReference>

<EarliestPriorityApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>0</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2022-09-08</FilingDate>

</EarliestPriorityApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="ru">Федеральное государственное

бюджетное учреждение &quot;Федеральный центр охраны здоровья

животных&quot; (ФГБУ ВНИИЗЖ)</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>FGBI ARRIAH</ApplicantNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Штамм «Рич» вируса коронавирусного

энтерита собак для изготовлении биопрепаратов для диагностики и

специфической профилактики коронавирусного энтерита

собак</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>2</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>786</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..786</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q1">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Canine Coronavirus</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>atgaaaattctgctgattctggcgtgcgtgattgcgtgcgcgtgcggcg

aacgttattgcgcgatgattagcgaaagcgataccagctgccgtaacggcaccgatagcacctgcgaaag

ctgctttaacggcggcgatctgatttggcatctggcgaactggaactttagctggagcattattctgatt

gtgtttattaccgtgctgcagtatggccgtccgcagtttagctggtttgtgtatggcattaaaatgctga

ttatgtggctgctgtggccgattgtgctggcgctgaccatttttaacgcgtatagcgaatatcaggtgag

ccgttatgtgatgtttggctttagcattgcgggcgcgattgtgacctttgtgctgtggattatgtatttt

gtgcgtagcattcagctgtatcgtcgtaccaaaagctggtggagctttaacccggaaaccaaagcgattc

tgtgcgtgagcgcgctgggccgtagctatgtgctgccgctggaaggcgtgccgaccggcgtgaccctgac

cctgctgagcggcaacctgtatgcggaaggctttaaaattgcgggcggcatgaacattgataacctgccg

aaatatgtgatggtggcgctgccgagccgtaccattgtgtataccctggtgggcaaaaaactgaaagcga

gcagcgcgaccggctgggcgtattatgtgaaaagcaaagcgggcgattatagcaccgatgcgcgtaccga

taacctgagcgaacaggaaaaactgctgcatatggtg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>262</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..262</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q8">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Canine Coronavirus</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>MKILLILACVIACACGERYCAMISESDTSCRNGTDSTCESCFNGGDLIW

HLANWNFSWSIILIVFITVLQYGRPQFSWFVYGIKMLIMWLLWPIVLALTIFNAYSEYQVSRYVMFGFSI

AGAIVTFVLWIMYFVRSIQLYRRTKSWWSFNPETKAILCVSALGRSYVLPLEGVPTGVTLTLLSGNLYAE

GFKIAGGMNIDNLPKYVMVALPSRTIVYTLVGKKLKASSATGWAYYVKSKAGDYSTDARTDNLSEQEKLL

HMV</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к области биотехнологии и касается нового штамма «Рич» вируса коронавирусного энтерита собак семейства Coronaviridae рода Alphacoronavirus, депонированный во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вируса ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером №376 - деп/22-10. Представленный штамм репродуцируется в перевиваемых культурах клеток почки кошки (CRFK) и в перевиваемой культуре клеток селезенки кошки (FS). В перевиваемой культуре клеток почки кошки CRFK в течение 72 часов инкубирования титр инфекционной активности вируса достигает значений 3,42±0,14 lg ТЦД₅₀/см³, сохраняя исходные характеристики при пассировании в клеточной культуре на протяжении 5 пассажей. Представленный штамм может быть использован для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики коронавирусного энтерита собак и для контроля антигенной активности вакцин против данного заболевания. 3 ил., 5 табл., 7 пр.

Штамм «Рич» вируса коронавирусного энтерита собак семейства Coronaviridae рода Alphacoronavirus, депонированный во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вируса ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером №376 - деп/22-10 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ», предназначен для изготовления биопрепаратов для специфической профилактики коронавирусного энтерита собак.