Способ получения веществ, стимулирующих клеточное дыхание Советский патент 1992 года по МПК A61K35/14 A61K31/00 

-Изобретение относится к биохимии и может быть использовано для получения физиологически активных веществ в лабораторных и промышленных условиях.

Цель изобретения - ускорение способа и снижение содержания солей в целевом продукте.

Способ осуществляется следующим образом.

Телячью кровь подвергают дефибрини- рованию путем интенсивного перемешивания, затем фильтрацией отделяют фибрин. После дефибринирования и объединения порций крови в нее можно добавить консервант, затем кровь сразу замораживают и в замороженном виде хранят до последующей переработки Дефибринированную кровь подвергают химическому или механическому гемолизу. Полученный гемолизат подвергают непрерывной многоступенчатой ультрафильтрации с использованием мембран, пропускающих соединения с мол.мае. не более 8000 Дальтон. Предпочтительно применять мембраны из триаце- татцеллюлозы или гидрофильного полиолефина.

В результате ультрафильтрации получают продукт с мол.мае. не превышающим 8000. Остающуюся после переработки в процессе ультрафильтрации кровь отбрасывают. Полученный ультрафильтрат, не содержащий белков и высокомолекулярных соединений, концентрируют при пониженном давлении и температуре не выше 40°С до плотности (при 20°С) 1,10-1,15 г/мл. При. этом удаляется органический растворитель

4

4 00

о со

vj

ICO

(использованный при гемолизе и консервировании крови) и консервант Получают раствор с концентрацией сухого вещества 180--230 мг/мл. Этот раствор для частичного удаления содержащихся в нем неорганических солей и получения раствора с молярностью 250-550 мосмоль, электропроводностью 40-75 mS/см или плотностью (при 20°С) 1.05-1,08 г/мл подвергают электродиализу. Для электродиализа используют блок из чередующихся катионо- и анионообменных мембран, пропускающих соединения с мол.мае. не более 400. Процесс проводят при плотности тока 5-70 мА/см свободного сечения мембраны, постоянном напряжении 0,2-2 В на мембрану и температуре 0-30°С.

Полученный водный раствор, содержащий стимулирующие клеточное дыхание вещества, можно использовать непосредственно, разбавить или концентрировать. Эти вещества можно применять для ускорения процессов заживления.

П р и м е р 1. Ультрафильтрация,

Используют четырехступенчатую ультрафильтрационную установку типа В 1 фирмы Paterson Candy International Ltd. В каждой из 4-х ступеней (1-4) установки имеется по 2 ультрафильтрационных трубчатых модуля с фильтрующей поверхностью каждого модуля 1,7 м . Мембраны модулей выполнены из ацетилцеллюлозы и пропускают соединения с мол.мае не более 8000. В качестве напорных насосов используют ротационные насосы с производительностью около 1000 л/г при давлении 10 бар. Для подвода и отвода продуктов используют дозирующие насосы Pg-P, соответственно . производительность которых можно менять в пределах 2-20 л/г.

Имеются 4 емкости Ti-T4 объемом 300 л, Температура растворов с помощью питаемых охлаждающей водой холодильников поддерживается равной 18°С.

В емкости Ti-Тз заливают по 250 л дефибриллированной и гемолизированной телячьей крови, содержащий 15 об,% консерванта (2 мас.% объем спиртовой раствор смеси метилового и пропилового эфиров 4-оксибензойной кислоты, взятых в весовом соотношении 9:1). Затем пускают насосы Pi- Рз, в результате чего вытекает ультрафильтрат UF, и когда содержимое емкостей Ti-Тз уменьшается рс 150 л, запускают питающие нэсось Рз-Рт и отводящие насосы Рв-Рю. Насосом РБ со скоростью 10 л/ч подается дефибринированная и гемоли- зированная кровь, содержащая консервант. Одновременно с помощью насосов Ре и PY в емкости Т2 и Тз в качестве разбавителя

подается со скоростью 10 л/ч раствор консервирующей добавки KL, содержащий 85 об.% воды и 15об.%: 1% (мае.:объем)спиртового раствора смеси метилового и пропилового эфиров 4-оксибензойной кислоты, взятых в весовом соотношении 9:1. Производительность насосов Рв-Рю регулируется таким образом, чтобы объем жидкостей в емкостях оставался постоянным, равным 150л. При этом в емкости Т2 иТз подают такое количество разбавителя KL, которое компенсировало бы количество вытекающего ультрафильтрата UT.

Как только в емкости Тз набирается 120 л

раствора, поступающего со ступени 3, включают подающий насос Р4. Вытекающую из емкости ТА через переливной патрубок отработанную кровь отбрасывают. Через 36 ч во всех четырех ступенях

устанавливается равновесие. Ультрафильтрат собирают для концентрирования. Количество ультрафильтрата, вытекающего на 1-й ступени 4,7 л/ч, на 2-й ступени 11 л/ч, на 3-й ступени 10,4 л/ч, на 4-й ступени 1,8 л/ч.

Производительность насоса Ре составляет 5,3 л/ч. Рд 4,3 л/ч, РЮ 3,9 л/ч, а количество отработанной крови АВ, вытекающей из емкости Р4 2,1 Л/Ч.

Концентрирование, Ультрафильтрат

подвергают дистилляции при давлении 30 мбар и 35°С, при этом отгоняется содержащийся в растворе консерванта спирт и большая часть консервирующего средства выпадает в осадок и отфильтровывается. К

фильтрату добавляют концентрированную соляную кислоту до рН 5, в результате чего остаток консервирующего средства выпадает в осадок, который отделяют фильтрованием. Полученный продукт с плотностью (при

20°С) 1,13 мг/мл используют на последующей стадии электродиализа (исходный концентрат N° 733.10). Из другой порции крови Получен концентрат № 350.03.

Электродиализ. Исходные концентраты

деляг на порции, подвергаемые затем электродиализу. Из концентрата 733.10 получают злектродиализаты N° 12 и 13, из концентрата N° 350.03 - электродиализаты № 14-19.

Процесс проводят в установке для элек- тродиализэ BEL 2 фирмы Berghog GmbH в основную часть установлен блок, состоящий из 7 пар анионообменной (а) и катионооб- менной (к) мембран (тип CMV и AM). С каждои стороны блока дополнительно имеется по одной мембране (к).

Используют мембраны, пропускающие соединения с мол.мае. не выше 400, К мембранному блоку подсоединены 3 циркуляционных контура. Из емкости Ti с помощью

насоса Pi через холодильник К подается подвергаемый обессоленный раствор 0(ди- люат). Из емкости Т2 с помощью насоса г через холодильник К2 подается водный раствор К, в который переходят соли. Из емкости Тз с помощью насоса Рз подается 2% (мас.объем) водный раствор сульфата натрия Е, предназначенный для промывки электродов. В холодильниках Кч и Ка отводится тепло: температура рзстворов поддерживается 25°С.

На линии циркуляционного контура дилюата Д после холодильника Ki смонтирована измерительная ячейка для определения электропроводности LF. Количество поступающего после концентрирования ультрафильтрата UK регулируется с помощью двухпозиционного регулятора R.

Со стороны концентрата из емкости Тз непрерывно отводится часть образующегося более концентрированного раствора солей КА, взамен которого с помощью -насоса PS подается соответствующее количество дистиллированной воды W. Кроме того, в мембранном блоке имеет место перенос некоторого количества воды со стороны дилюата в направлении образования концентрата.

Часть дилюата Д после измерения электропроводности в измерительной ячейке 2F непрерывно отводят и после пропускания через стерилизующий фильтр SF в качестве готового продукта Р хранят до последующей переработки в фармацевтические препараты в емкости ТА при 0°С.

Для запуска установки для электродиализа в 2-литровую емкость TI заливают 1,2 л полученного концентрированного ультрафильтрата UK В емкость Т2 такого же объема заливают 1 л дистиллированной воды, а в однолитровую емкость Т 750 мл 2%-ного раствора Na204. Запускают насосы Pt-Рз, подающие растворы со скоростью 90 л/ч. К электродным пластинам (+ и -) прикладывают постоянное напряжение такой величины, чтобы через свободное сечение мембраны протекал ток плотностью 20 мА/см2. При сечении мембраны 37 см2 общий ток равен 750 мА. Начальное напряжение 16 В в течение часа снижают до стационарной величины 5,5 В (для блока, состоящего из 5 пар мембран). Через 10 ч электропроводимость раствора снижается до величины 45-50 5 mS/см. С помощью дозирующего насоса Р4, управляемого регулятором Р, устанавливается такой расход поступающего концентрированного ультрафильтрата, чтобы электропроводность дилюата оставалась в 0 пределах 45-50.

Производительность дозирующего насоса PS устанавливают равной 200 мл/ч Количество выходящего из емкости Т2 концентрата соли КА составляет 220 мл/ч. 5 Процесс диализа повторяют несколько раз. В результате осуществления способа получают электродиализаты N 12-19, условия получения и свойства которых представлены в табл. 1 и 2. Дополнительные данные 0 для диализатов, полученных из других порций крови, представлены в табл. 3 и 4,

Предлагаемый способ позволяет ускорить получение биологически активного вещества и снизить содержание в нем солей. 5 Формула изобретения

Способ получения веществ, стимулирующих клеточное дыхание, путем дефибринирования телячьей крови и от- фильтровывания образующегося при этом 0 фибрина, гемолиза полученного раствора, отделения содержащихся в нем веществ с мол.м. выше 8000 Дальтон мембранным способом разделения и частичного отделения содержащихся в полученном растворе 5 неорганических солей, отличающийся тем, что, с целью ускорения способа и повышения качества целевого п-родукта за счет снижения содержания в нем солей, отделение веществ с мол.м. выше 8000 Дальтон 0 осуществляют путем непрерывной многоступенчатой ультрафильтрации, а частичное отделение неорганических солей - путем электродиализа с помощью пакета ячеек из чередующихся катионо- и анионообменных 5 мембран с проницаемостью мембраны до мол.мае. 300 Дальтон при плотности тока 5-70 мА/см свободного поперечного сечения мембраны, напряжении 0,2-2 В на мембрану и температуре 0-30°С.

Таблица 1

Изобретение относится к биохимии и может быть использовано для получения биологически активных веществ в лабораторных и промышленных условиях. Цель изобретения - ускорение способа и снижение содержания солей в целевом продукте. Способ состоит в дефибринировании и гемолизе крови теленка с последующим отделением веществ с мол.мае. выше 8000 Дальтон путем непрерывной многоступенчатой ультрафильтрации, концентрированием ультрафильтрата и частичным отделением солей электродиализом с помощью пакета ячеек из попеременно расположенных катионо- и анионообменных мембран с проницаемостью мембраны вплоть до мол.м. 300 Дальтон при плотности тока 5-70 мА/см свободного поперечного сечения мембраны, постоянного напряжения 0,2-2 В на мембрану и температуре 0- 30°С. Полученное соединение обладает свойством стимулировать клеточное дыхание и обладает ранозаживляющим действием. 3 табл. со

Все значения выше 1,0 являются положительными; количественное разграничение

не представляется возможным

Измеренные значения относятся к ультрафильтрату, разбавленному стерилизованной водой в 5 раз.

Измеренные величины относятся к электродиализату, разбавленному стерилизованной водой в 5 раз

Таблица 2

Таблица 3

Таблица 4