(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЕТЕРОВАКЦИНЫ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ СИНДГОМА ТРИХОМОНАДА
1
Изобретение относится к медицине.и касается способа получения Ъетеровакцины для лечения синдрома трихомонада.
Известен способ получения гетеро вакцины, заключающийся в том, что на -питательных средах отдельно выращивают культуры микроорганизмов (коклюшные, дифтерийные, столбнячные), затем смешивают в определенных пропорциях убитые коклюшные микроорганизмы и анатоксины изобретения - получение гетеровакцины для лечения синдрома трихомонада.
Указанная цель достигается тем, что согласно способу получения гетеровакцины для лечения синдрома трихомонада Lactobacter1um acidophilum штаммы CBS 465,77, CBS 466.77,, CBS 467.77, CBS 468.77, CBS 469.77, CBS 470.77, CBS 471.77. и/или CBS 472.77 порознь выращивают в жидкой питательной среде в аэробных условиях, отделяют полученную биомассу, инактивируют ее и смешивают 3-8 штаммов микроорганизмов в равных количествах в физиологическом растворе или в объемах, обратно пропорциональных концентрациям микроорганизмов.
При этом выращивание осуществляют при рН 6,1-6,8 и 32-45 С.
Инактивацию проводят 0,3%-ным раствором формальдегида и 0,5%-ным раствором фенола. . Кроме того, с целью повышения устойчивости гетеровакцины, после смешения микроорганизмов добавляют формальдегид, фенол или натрий-этилртуть тиосалицилат .
Штаммы взяты в 1976 г. из влагалища женщин, страдакяцих синдромом трихомонада .
Штаммы внесены 17.10.77 в лиофи-. , лизированном состоянии в Centreal bu reau voor Sch iramel -cultures (BaopH, Нидерланды ) под обозначением от CBS 465.77 до CBS 472.77 ( восемь отдель ных штаммов),
Все восемь штаммов являются грамполржительными, имеют форму цепей или палисада.
Штаммы различны по морфологии и величине образующихся колоний, отдельные колонии очень малы и имеют форму круга, другие колонии больше и
имеют форму розетки с бороздками на поверхности.
Биохимические свойства штаммов представлены в табл. 1.
Таблица
Штаммл CBS 466.77, 467.77 и 469.77 обладает одинаковыми биохимическими и ферментативными свойствами.55
Штаммы подобраны таким образом, что при применении всех восьми штам.мов получают вакцину, эффективную для каждого пациента, с помощью которых независимо от происхождения ин- 60 фекции успешно вылечивают от синдрома трихомонада.
Для культивирования штаммов применяют жидкие питательные среды, наи-65
более целесообраз следукэдий состав:
Триптоэо-пептон, г
Гидролизат.
казеина, г .
Мясной
экстракт, г
Диализат
дрожже.воЛ, мл ., г
Триаммоний
цитрат, г Ацетат натрия, г5 Солевар смесь, мл5 , Твин-80 мл1 Глюкоза, г10 , Лактоза, г10 Дистиллированная ,вода, мл До 1000 Солевая смесь состоит из, г: МдЗОд 7 ,5 MnSO 2 ,4 FeSO. . 7 HiO0,68 Дистиллированная вода, мл До 100 рН жидкой питательной среды доводят до 6,1-6,8, предпочтительно 6,5, среду.стерилизуют в актоклаве при 20 мин, затем разливают по колбам Эленмейера, куда вносят об разцы каждого штамма. Культивирование проводят при , .предпочтительно при 48 ч. По истечении этого времени ма риал собирают в стерильных условиях и центрифугируют 1 ч при 3000 д, Осадок, образовавшийся из биологического материала, переводят в суспензию, предпочтительно в физио логическом растворе, и затем инакти вируют обработкой формальдегида и фенолом, предпочтительна концент рация суспензии 0,3% в расчете на формальдегид и 0,5% в расчете на ф нол при длительности обработки 3-5 дн. После йнактивирования суспензию снова центрифугируют 1 ч при 3000 д чтобы освободить инактивироваНный материал от избытка формальдегида и фенола. Материал, полученный от каждого отдельного штамма, снова переводят в суспензию, предпочтительно в физиологическом растворе, и провод испытание на стерильность и .на наличие жизнеспособных лактобактерий При отрицательных результатах этих испытаний определяют плотность кул туры для. каждого штамма или число микроорганизмов на 1 мл культураль ной жидкости. При .невозможности смешивания от дельных суспензий непосредственно после инактивации их хранят при 4 либо каждый штамм лиофилизируют и этом состоянии хранят при 4°С не менее 3-х лет. В качестве защитног коллоида для лиофилизации пригодна среда, состоящая,из, %: желатин 5, сахароза 37,5 и лактобионат кальци 0,5. Лиофилизацию проводят 24 ч. Инактивированный материал из от .дельных штаммов смешивают в равных количествах. Полученную вакцину ра бавляют физиологическим раствором так, что она содержит в 1 мл 14-10 микроорганизмов. Общее содержание азота в вакцине составляет 3,68% сухого вещества. Для повьаиения устойчивости к вакцине добавляют консервирующее средство, например формашьдегид или ф.енол, в концентрации 0,25% или этил-ртутьтиосалицилат натрия и оставляют вакцину при 30 дн, прежде чем заполнить ею ампулы емкостью 0,5 мл. Заполнение апирогенных ампул производят в стерильных условиях, ампулы лиофилизируют и хранят при 4°С. При 2-8с вакцина сохраняется три года, при 20°С - 6 мес. Вакцину испытывсиэт на стерильность, токсичность, антигенное действие и наличие жизнеспособных лактобактерий.. Для испытания на стерильность по 1 мл вакцины помещают в пробирки с тиогликолевой питательной средой и с бульоном -Сабуро ,, пробирки инкубируют 10 дн при З7с и соответствукнций ряд обработанных пробирок инку-. бируют в течение того же времени при . Все пробирки в рядах .оказались стерильными. Испытание на токсичность производят на морских свинках и белых мышах. Пяти морским свинкам со средним живым весом 300 г внутриьйлшечно вводят по 5 мл вакцины С по 2,5 мл в каждую заднюю конечность). После наблюдения в.течение 14 дн все животные остались , здоровы,в обработанных конечностях не Обнаружено никаких реакций .Вакцину в, дозе 0,5 мл вводят-также в заднюю конечность десяти белым мышам со средним живым 20 г. После йаблюяения в течение 14 дн все оказа-/ лись здоровыми. Испытание на антигенное действие проводят сначала на трех морских свинках, которым через 14 дн вводят внутрисердечно по 5 мл вакцины, . при этом никакой анафилактической реакции не наблюдается. Затем вакциг ну испытывают in vitro в реакции нм мунодиффузии по Оухтерлони с нормальной человеческой сывороткой, при этом положительная реакция отсутствует.; Для испытания на наличие жизнеспособных лактобактерий пробы вакцины культивируют на плотной питательной среде следующего состава: Вода, мл800 Трипказеин, г 16 Раствор 1, мл50 Раство.р 2, мл10 Раствор 3, МП10 Раствор 4, мл10 Свежиедрожжи, г 10 Пептон серебряный, г 10 . Крахмал растворимый 0,5%-гный, г 5 Вода, мл До 1000 Раствор 1 состоит из 10%-ного раствора NaCI , раствор 2 состоит из 2%-ного раствора КС1 и 5%-ного раст вора , раствор 3 состоит из 2%-ного раствори 1 -ного раствора MgCl и раствор 4 состоит из 2,5%-ного раствора Kj HPOjj.. К полученным растворам добавляют 25 г агар-агара, доводят рН до знач ния 5,5-6,7, предпочтительно б, и стерилизуют 20 мин в автоклаве при . Затем добавляют 100 мл водно раствора, содержащего 3 г мальтозы, 10 г глюкозы и 10 г лактозы, после чего добавляют 30 мл 1%-ного раство ра цистеингидрохлорида, причем каждый из этих растворов предварительно стерилизуют через стеклянный фильтр GjВ последнюю очередь в среду вносят 10% дефибринированной человечес кой крови. Питательную среду засевают пробами вакцины и посевы инкубируют при . В качестве контрол среду засевают Lactobacterгцт асГЬорНИит,и культивирование осущест вляют при тех же условиях. В вакцине не обнаружено ни одног жизнеспособного микроорганизма. Tie. она является убитой, при этом она оказывает действие против инфекций, вызываемых микроорганизмами вида Тг i chomonas vaginal is, т.е. от носит.ся к классу гетеровакцин. Вакцина вызывает образование спе цифических антител против Lactobacter I urn acidophilum, в частности про тив полиморфных форм, ответственных Эа патологические изменения величины рН влагалища при трихомонадном синдроме. Иммунизирующее действие вакцины доказано на следующих опытах с животными и клинических испытаниях. Двум кроликам с живым весом 2950 г и 3200 г делают внутривенное вливание с интервалом в 2 нед. Через
16
1:10
1:10
1:20
О 3 месяц после второго вливания берут кровь и выделяют сыворотку. В случае образования антител дают сыворотке агглютинироваться в разведении 1:50 лактобактериями тех штаммов, из которых готовится вакцина, при этом сыворотка в исследуемом разведении имеет положительный tHT.p агглютинина.. У обоих кроликов титр агглютинина перед вливанием был отрицательный при разведении 1:10, через месяц после второго вливания титр стал положительным при разведении 1:160 или 1:180. Вакцина позволяет проводить лечебную и профилактическую обработку синдрома трихомонада ( острого, хронического и асимптоматического). Для лечебных .и профилактических делей рекомендуется дозировка О,5 мл (7 -ID микроорганизмов) внутримышечно, три раза с интервалом в две недели с побледующим введением той же дозы инъекцией Раннеля через год после начала.лечения. Клинические исследования проводят на 97 пациентках, которые подвергаются серологическим исследованиям. У пациенток согласно временному графику отбирают кровь и полученную сыворотку КР0ВИ испытывают на присутствие лактобактериальных антител. Для этого сыворотку в возрастающем разведении Сот 1:10 до 1:1280) обрабатывают вакциной из соответствующих антигенов или агглютининов и наблюдают происходящую агглютинацию. В качестве агглютининов используют свежеприготовленную суспензию инактивированных микроорганизмов LactobacteriUrn acfdophilum тех же штаммов в том же весовом соотношении и,,,э той же концентрации (14-10 микроорганизмов на 1 мл, что и сама вакцина. Появление в сыворотке агглютинина и нарастание его титров показано в табл. 2. Таблица 2 Учитывая повышение титра агглюти- 40 иина в период между первым и вторым Повышение титра 2Х Число пациенток 13 Доля пациенток от об13,4 21,6 щего, % 13,4
Приме Р 200 женщин в возрасте 15-59 лет, страдающих синдромом трихомонада, амбулаторно лечились вакциной, изготовленной- из 8 штаммов. Контроль осуществляло на протяжении 2-х лет. 138 пациенток (69% от общего кс личества) прежде безуспешно лечились метронидазолом. Перед начапом лечения наряду с исследованием
:Продолжение табл. 2
крови и мочи .проводилось гинекологическое исследование, включая колпоскопию и исследование по Pap-Smear,
параллельно были взяты мазки из влагалища, вульвы, шейки матки иурехры для приготовления нативных препаратов и препаратов, окрашенных по . Граму и Гимзу. Культура была нанесена на Trichomonas vagi nails. Исслёзабором крови, пациенток можно распределить, как указано в табл. 3. ТаблицаЗ 64Х и более 7 10,3 6,2
дования были повторно проведены через б нед, 4 и 12 мес- после начала лечения..
Перед началом лечения у 145 пациенток 172,5%) была установлена выраженная симптоматика синдрома трихомонада с сильным кольпитом, зудом обильными зелено-желтоватыми дурно пахнущими беЛями, диспареунией и дизигией, при колпоскопии выявлены отек и эритема эпителия и влагалищной части шейки матки и влагалища. Кроме того, у 61 пациентки была установлена эритроплакия влагалищной части шейки матки, у 13 - хронический цервицит. У остальных 55 пациен ток С 27/5%) обнаружен только легкий кольпит.
Лечение проводилось согласно приведенной дозировке. В случаях легПеред началом
200 вакцинации
139
200 (69,5%)
164
198 С82%
157
198 (79,3%.;
Девять пациенток, у которых при втором контроле (через три месяца после вакцинации) микроскопически еще определялась Trichomonas vaginal is, остались невосприимчивыми далее к лечению, пероральное ввёдение трихомонацида также ничего не изменило.
Через 12 мес также остались изменения шейки матки в форме хронического цервицита или значительной эритроплакйи , что объясняется тем, что эти
iKoro кольпита дополнительная терапи не применялась/при острых симптомах : назначали антибиотики, а при тяжелых состояниях - дополнительно локальное применение препарата из штаммов Lactobacterturn acldophllum, эффективного против MonIIt a s i s. Метронидазол или подобные ему нитроимидазольные производные не назначали ни в одном случае. Если выделения из влагалища классифицировать по ifirovec, то успешность лечения можно проследить ио табл. 4, где класс I означает отсутствие заболевания, класс II -, нёгнойные бактериальные бели, класс III - гнойные бактериальные бели, клас.с 1У - гонорея (исследованию такие случаи не подвергались;, класс V - трихомонад (положительный нативный препарат), класс VI - микоз влагалища (Candida alb Jeans).
; Таблица 4
6
194 C3%j
(97%;
14
(7%; (23,5%;
27
(4,5%; (13,5%)
9
32 (16,2%У
(4,5%;
йсенщины способны к образованию антйтел. 198 (95,5% пациенток, подвергшихся лечению, через 12 мес были вылечены от трихомоноэа(до лечения у них выделялись вагинальные бели по классу II и III). Тот же результат был получен у 55 пациенток с легкими кольпитами без дополнительной терапии. Пациентки через два года снова подвергались наблюдению, за это время не выявилось ни одного случая реинфекции. Во время лечения и после него не было установлено никаких аллергии ческих и .токсических-реакций, однако следует воздержаться от вакцинации 3 случае острых лихорадочных .инфекций, болезней систеьш гематопоэза или тяжелой почечной недостаточности. Формула изобретения 1. Способ получения гетеровакцины для лечения синдрома трихрмонада 3 а к л ю ч а ю щ и и с я FTOM,, что Lactobacterlura acldophllum штам мы CBS 465.77, CBS 466.77, CBS467.7 CBS 468.77, CBS 469.77, CBS 470.77/ CBS 471.77 и/или CBS 472.77 порознь выращивают IB скидкой питательной сре да ri.-аэробных условиях, отделяют полученную биомассу, илактцвируют ее и смешивают 3-8 штаммов микроор|ганизмов в равных количествах в ,физиологическом растворе или в объемах, обратно пропорциональных концентрациям микроорганизмов. 2.Способ по п. 1, о т л и ч а ю д и и с я тем, что выращивание осуществляют при рН 6,1-6,8 и 3245 С. 3.Способ по п. 1, о т л и ч a-s ю щ и и с я тем, что инактивацию проводят 0,3%-ным раствором формаль дегида и 0 5%-ным раствором фенола. 4.Способ по п. 1, о т л и ч аю щи и с я тем, что, с целью повы шения устойчивости гетеровакцины, после смешивания микроорганизмов .добавляют формальдегид, фенол или натрий-этилртутьтиосалицйлат. Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1. МРТУ-42 263-68 на АКДС вакину.
