ел
tc
Изобретение относится к медицине- кой микробиологии, а именно к способам получения лечебных вакцин.
Пример. Сначала от пациентов : которые страдали от инфекции .мбчевых путей, получают пробы мочи (средне- струйная моча) и сразу делают пересе на агар MacConkey. После засевания пластины с агаром инкубируют в точе ние 16-18 ч при 37 С, затем вьиалягот образованные колонии и идентифицирую определением их биохимических и биологических свойств.
Индентифицирование Streptococcus faecalis (энтерококка) с использованием метода окраски по Г раму характерных небольших КОЛОНИ11 и следующих испытаний:
каталаза (в присутствии -- подогретой крови) + гемолиз-/б
рост при
рост при рН 9,6 + рост в 6,5%-ном растворе NaCl. -f
р( zT на 40% желчи + . определение полисахарида - антигена D ,+
В табл. 1 приведены критерии, при меняемые для идентификации штаммов Escherichia coli, Proteus и Klebsie la
Идент1фицированные таким образом колонии оставляют на пластинах с агаром в течение 24 ч при 37 С для /дальнейшего роста, затем суспендируют в физиологическом растворе хлористог натрия, испытьюают на чистоту при помощи метода окраски по Граму и за- мораживают в сухом виде.
Полученные отдельные штаммы Escherichia coli характеризуются признаками, приведенными в табл. 2.
В табл. 3 приведены биохимические свойства штаммов Escherichia coli. . В табл. 4 представлены признаки, характеризующие штаммы Proteus и Klebsiella.
Биохимические свойства штаммов Proteus и Klebsiella представлены в
табл. 5.
. В табл. 6 представлены признаки, характеризующие штамм Streptococcus
faecalis.
--
Биохимические свойства штамма Streptoco.ccus faecalis приведены в табл. 7.
- Q
5
0
0
-
Морфологические свойства выделенных штаммов можно обобщить следующим образом.
Escherichia coli: грамотрицатель- ные налочки, 1,1-1,5 2,0-6,ОЦ( м (живая форма), подвижны благодаря жгутикам.
Proteus rairabilis и Proteus mor- ganii: грамотрицательные палочки, 0,4-0,60,1-3,0 без оболочки, подвижны, со жгутиками (не все).
Klebsiella pneumoniae: грамотрицательные, неподвижные палочки, 0,3- 1,5-0,6-6,0|UM.
Strept,ococcus faecalisi грамотрицательные шарообразные кокки, 0,5- 1,0 HIM, неподвижные.
Штаммы Escherichia coli исследуют затем на их серологические свойства, и для этой цели сначала на предметном стекле проводят тест на склеивание с многовалентными ОК-сьшоротками А, В, С, D, Е. Данные приведены в табл. 8, Указанные 10 штаммов депонированы в Центральном Бюро плесневых культур (Нвдерланды) под названиями CBS 516.84 до CBS 525. переведены в немецкую коллекцию микгоорганизмов (ФРГ) под входящими номерами DSM 3229-DSM 3238.
Для получения вакцины штаммы отдельно культивируют на твердой или жидкой питательной ст)еде; предпочтительно применяют твердую пита- . тельную среду, например питательный агар, который имеет следующий состав, г/л:
Мясной экстракт (Difco Beef Extract)3 Бакто-пептон5 Хлористый натрий 5 Бакто-агар15 Среду стерилизуют в течение 15 мин при 121 С, она имеет рН около 7,2.
Для промьшшенного получения применяют Roux-баллоны, для получения в лаборатории применяют чашки Петри. Инокуляцию осуществляют при помощи посевного материала, несколько миллиметров которого равномерно распределяют по всей поверхности. Roux-баллоны закрывают бумажной пробкой и среду хранят на складе инокулирован- ной поверхностью вниз. Инокулирован- ные культуры инкубиру5 зт в течение 24 ч при 37°С.
Поверхность разрастания колонии бактерий смьЕвают необходимьгм количеством (в зависимости от плотности роста культуры в сосуде) буферного раствора фосфата - раствора хлористого натрия (PBS) при легком раскачивании, не нарушая поверхности агара.
Из каждого баллона или из каждой чашки Петри берут мазок, окрашивают по методу Грама и проверяют на чистоту. Баллоны или чашки Петри, которые окажутся загрязненными, выбраго 2,5-10, всего 1,5-10 микробо.-;
Proteus mirabilis 1 штамм, 7,5-10
микробов; Proteus morganii . I штамм.
7,510
moniae
Stregtococcus faecali.s 1 штамм.
микробов; Klebsiella pneu- 1 штамм, 310 микробов;
10
5-10 микробов. Вместе - 2-10 микробов /мл.
Так как добавляют алюминийфосфат- ный гель, концентрация соответственно должна быть выше. Апюминийфосфат- ный гель получают следующим образом.
854 г калийалюминийсульфата «
сьшают. Суспензии, .которые происходят 15 х12 Н,0 растворяют в 6л воды и филътот одного штамма или от сбора, смешивают с помощью стерильного сита из нейлоновой ткани.
Инактивирование, как и само культивирование, для каждого штамма проводят отдельно. Его можно осуществлять нагреванием при температуре около 55-60 С в течение приблизительно I ч, обработкой раствором
руют. Затем растворяют 685 г три- натрийфосфата 12 в 6 л воды. Раствор алюминия выдерживают при 37 С. Оба раствора одновременно вы- 20 ливают в 21 л воды. Осадок центрифугируют, повторно суспендируют в 13 л воды и суспензию -снова центрифугируют.
Далее осадок повторно суспендим. - JCг-1 «« V «-. J.X i rnj V-.J IJ ИСГ1.ЦИ
формальдегида ипи облучением -лучами, 25 руют, доводят до общего объема 8,1
Полученные ЙИПМЯГ Г КТ ППО TTtlucrtrtfriггтлт-тчоtmr« t
Полученные биомассы соединяют, инактивируют на водяной бане при 6 С в течение 1 ч и после теплового инактивирования добавляют фенол (предельная концентрация 0,35%).
Пробу суспензии берут для опыта на стерильность и для испытания на идентичность и концентрированное запасное количество хранят в холодильном шкафу.
Если опыты на стерильность через ,3 дня не показали никаких загрязнений, процесс получения ведут дальше. За опытом на стерильность наблюдают в течение 14 дней и если проба на стерильность показьшает рост каких-нибудь организмов, этот сбор устраняют.
Содержимые сборников (инактиви- рованные суспензии, которые происходят от одного щтамма) центрифугируют при 3000 об/мин в течение 1 ч в охлажденной центрифуге (Sorval 4 CR, центробежный ротор 2000), супернатант удаляют, и осадок бактерий суспендируют в растворе хлористого натрия, который содержит 0,01% тиомерсаля. Суспензию хранят при 4° (+2 с).
Концентрированные суспензии 10 штаммов Е. coli, Proteus mirabilis, Proteus morganis, Klebsiella pneumoniae. Streptococcus faecalis смешивают таким образом, что в 1 мл содержится Е. coli 6 штаммов, каждо30
литра, устанавливают при помощи 5 н. NaOH величину рН 6,0 и вьщержи- вают в автоклаве в течение 1 ч при 121 С. Этого количества достаточно.
35
40
45
50
чтобы получить 66 л вакцины с 3 мг А1Р04/МЛ или 0,66 мг А1/МЛ.
Адсорбированную вакцину после проверки величины рН, которая должна составлять 6,2-7,0, разливают в стерильные не содержащие пирогена ампулы емкостью 1 мл в количестве 0,5 мл на дозу. Вакцину во время разливания взбалтьюают.
Общее число инактивированных микроорганизмов в одной дозе, т.е. 0,5 мл, составляет около 1-10.
Наконец, вакцину испытывают:
на стерильность по Европейской фармакопее;
на токсичность по предписаниям Всемирной организации здравоохранения (прирост веса у мьш1и) ;
на ненормальную токсичность по Европейской фармакопее.
Вакцина может быть получена в лио- филизированной форме.
Концентрированную инактивированную. суспензию, полученную аналогично опи- gg санному, разбавляют таким образом, чтобы она в 0,5 мл содержала около I lO инактивированных бактерий указанного состава. Для разбавления применяют 1%-ный раствор гуманальбумина
52462
го 2,5-10, всего 1,5-10 микробо.-;
Proteus mirabilis 1 штамм, 7,5-10
микробов; Proteus morganii . I штамм.
7,510
moniae
Stregtococcus faecali.s 1 штамм.
микробов; Klebsiella pneu- 1 штамм, 310 микробов;
10
5-10 микробов. Вместе - 2-10 микробов /мл.
Так как добавляют алюминийфосфат- ный гель, концентрация соответственно должна быть выше. Апюминийфосфат- ный гель получают следующим образом.
854 г калийалюминийсульфата «
15 х12 Н,0 растворяют в 6л воды и филътх12 Н,0 растворяют в 6л воды и филътруют. Затем растворяют 685 г три- натрийфосфата 12 в 6 л воды. Раствор алюминия выдерживают при 37 С. Оба раствора одновременно вы- ливают в 21 л воды. Осадок центрифугируют, повторно суспендируют в 13 л воды и суспензию -снова центрифугируют.
Далее осадок повторно суспендиг-1 «« V «-. J.X i rnj V-.J IJ ИСГ1.ЦИ
руют, доводят до общего объема 8,1
ггтлт-тчоtmr« t
0
литра, устанавливают при помощи 5 н. NaOH величину рН 6,0 и вьщержи- вают в автоклаве в течение 1 ч при 121 С. Этого количества достаточно.
5
0
5
0
чтобы получить 66 л вакцины с 3 мг А1Р04/МЛ или 0,66 мг А1/МЛ.
Адсорбированную вакцину после проверки величины рН, которая должна составлять 6,2-7,0, разливают в стерильные не содержащие пирогена ампулы емкостью 1 мл в количестве 0,5 мл на дозу. Вакцину во время разливания взбалтьюают.
Общее число инактивированных микроорганизмов в одной дозе, т.е. 0,5 мл, составляет около 1-10.
Наконец, вакцину испытывают:
на стерильность по Европейской фармакопее;
на токсичность по предписаниям Всемирной организации здравоохранения (прирост веса у мьш1и) ;
на ненормальную токсичность по Европейской фармакопее.
Вакцина может быть получена в лио- филизированной форме.
Концентрированную инактивированную. суспензию, полученную аналогично опи- gg санному, разбавляют таким образом, чтобы она в 0,5 мл содержала около I lO инактивированных бактерий указанного состава. Для разбавления применяют 1%-ный раствор гуманальбумина
или заменителя плазмы с 0,01% тиомер- саля в 0,85 н. растворе ЫаС1.
Флакончики объемом 2 мл наполняют при стерильных условиях 0,5 мл описанной разбавленной суспензии, замораживают приблизительно при -45°С, после этого сушат в вакууме в лиофи- лизационном аппарате. Температура
штаммов бактерий сус1тендируют с 9 мл питательной среды и инкубируют культуру при 37°С в течение 24 ч. Вторую вспомогательную культуру применя ют для приготовления антигенов. 600 мл питательной среды инокули- руют при помощи посевной культуры (каждый штамм отдельно). Культуры
сушки не должна превьш1ать +3б с. Весь 10 -инкубируют jipH З7 с в течение 36 ч. процесс лиофипизации продолжается После этого добавляют формалин до 24 ч. После лиофилизации флакончики закрьшают резиновыми пробками в атмосфере азота и алюминиевыми колпач15
ками.
Для введения алюмиг..лйфосфата, одновременно используемого в качестве растворителя для повторного растворения, перед назначением применяют водный алюминийфосфатный гель с концентрацией AlPG 2 мг/мл. Алюминий- фосфатный гель, прежде чем его разливают в ампулы, разбавляют раствором хлористого натрия до такой степени (около 12 раз), чтобы конечная концентрация была 2 мг/мл.
Разливаемое количество в ампулы емкостью 1 мл составляет 0,5 мл.
Для испытания вакцины на стой- кость при хранении дважды определяют ее способность к образованию антител
у МЬШ1И.
Иммунизация мышей.
Шести группам по 10 мышей каждая (мужского пола, NMRl-штамм, вес 16- 20 г) проводят иммунизацию интрапери- тонеальным введением вакцины. Две дозы (0,5 мл вакцины) впрыскивают с интервалом в две недели. 20 мьшам из того же выращивания и с таким же весом, которые служат в качестве контрольной группы, бпрыскивают только алюминийфосфатный гель (0,5 мл). Через две недели после второй инъек-. ции берут стерильно кровь и объединяют по группам. После свертывания получают сьшоротку от каждого объединения центрифугированием и хранят при глубоком замораживании при -22°С до серологического испытания.
Приготовление антигенов (агглюти- ногенов).
Девять гомологических щтаммов бактерий, которые содержатся в вакцине, применяют для получения антигенов; штамм ЕС 654 нельзя бьто агглютинировать (R-форма) и его нельзя применять в качестве агглютй- ногена. Лиофилизированные культуры
конечной концентрации 0,1%. Культуры инкубируют при 37°С в течение 7 дней Каждую культуру испытьшают после этого на отсутствие живых бактерий и на стерильность. Инактивированную суспензию бактерий центрифугируют в охлаждающей центрифуге в течение 1 ч при 3000 об/мин. Осадок повторно
20 суспендируют в буферном растворе фос фата - растворе хлористого натрия (рН 7,2) - так, чтобы достигнуть концентрации около 20-Ю бакте- рий/мл. Для пробы на агглютинацию
25 применяют около 2-10 .бактерий/мл в качестве агглютиногена.
Опыт на агглютинацию.
Сыворотки мышей в 1:2-стадиях разбавления разводят буферным раство30 ром фосфата - физиологическим раствором хлористого натрия с рН 7,2. По прошествии 1У ч при 37°С и остальных 24 ч при 4 С снимают показания реакции. В качестве титра соответст2g вующей сыворотки принимают максимальное разбавление, при котором еще можно было установить видимую агглютинацию бактерий.
Для агглютининовых титров сьшоро40 ток мьшей были, найдены геометрические средние значения, приведенные в табл. 9.
Из этих результатов следует, что вакцина при хранении при 4°С сохраня45 ет свою полную эффективность по меньшей мере в течение двух лет.
Показаниями вакцины являются особенно цистит, простатит, цистопиелит и пиелонефрит. .
5Q Пациенты, которью не имеют острого лихорадочного состояния (противопоказание), получают с интервалами от 1 до 2 месяцев всего 3 внутримышечные инъекции по 0,5 мл вакцины.
gg При появлении сильных реакций на вакцину лечение следует прекратить.
Через год после этого следует провести ревакцинацию в той же дозе.
штаммов бактерий сус1тендируют с 9 мл питательной среды и инкубируют культуру при 37°С в течение 24 ч. Вторую вспомогательную культуру применяют для приготовления антигенов. 600 мл питательной среды инокули- руют при помощи посевной культуры (каждый штамм отдельно). Культуры
инкубируют jipH З7 с в течение 36 ч. После этого добавляют формалин до
-инкубируют jipH З7 с в течение 36 ч. После этого добавляют формалин до
конечной концентрации 0,1%. Культуры инкубируют при 37°С в течение 7 дней, Каждую культуру испытьшают после этого на отсутствие живых бактерий и на стерильность. Инактивированную суспензию бактерий центрифугируют в охлаждающей центрифуге в течение 1 ч при 3000 об/мин. Осадок повторно
суспендируют в буферном растворе фосфата - растворе хлористого натрия (рН 7,2) - так, чтобы достигнуть концентрации около 20-Ю бакте- рий/мл. Для пробы на агглютинацию
применяют около 2-10 .бактерий/мл в качестве агглютиногена.
Опыт на агглютинацию.:
Сыворотки мышей в 1:2-стадиях разбавления разводят буферным раствором фосфата - физиологическим раствором хлористого натрия с рН 7,2. По прошествии 1У ч при 37°С и остальных 24 ч при 4 С снимают показания реакции. В качестве титра соответствующей сыворотки принимают максимальное разбавление, при котором еще можно было установить видимую агглютинацию бактерий.
Для агглютининовых титров сьшороток мьшей были, найдены геометрические средние значения, приведенные в табл. 9.
Из этих результатов следует, что вакцина при хранении при 4°С сохраняет свою полную эффективность по меньшей мере в течение двух лет.
Показаниями вакцины являются особенно цистит, простатит, цистопиелит и пиелонефрит. .
Пациенты, которью не имеют острого ихорадочного состояния (противопоказание), получают с интервалами от 1 до 2 месяцев всего 3 внутримышечные инъекции по 0,5 мл вакцины.
При появлении сильных реакций на вакцину лечение следует прекратить.
Через год после этого следует проести ревакцинацию в той же дозе.
Формула изобретения
Способ получения вакцины для профилактики и лечения инфекции мочевых путей, заключающийся в том, что используют десять уропатогенных штаммов бактерий, из которых шесть штаммов Escherichia coli Ее 455 UB, Ее 525 UB, ЕС 560 ив, ЕС 616 ив, ЕС 654 UB и ЕС 719 ив и по одному штамму Klebsi- ella pneumoniae 16В, Proteus mirabi- lis 63B, Proteus morganis 58B и
Streptococcus faecalis 676, при этом все штаммы выращивают раздельно, ин- активируют тепловой обработкой при 55-60 С, или формальдегндом, или гамма-облучением, затем культуры смешивают, при этом конечная концентрация всех бактерий в вакцине составляет 2-10 клеток/мл, полученную смесь бактерий сорбируют на фосфате алюминия при концентрации его 1,5- 10 мг/мл вакцины и затем в целевой продукт добавляют тиомерсаль.
Таблица 1
название | год | авторы | номер документа |
---|---|---|---|
Способ получения гетеровакцины для лечения синдрома трихомонада | 1978 |
|
SU997599A3 |
ВАКЦИНА ПРОТИВ УРОГЕНИТАЛЬНЫХ ИНФЕКЦИЙ НА ОСНОВЕ ВАГИНАЛЬНОГО СУППОЗИТОРИЯ | 1998 |
|
RU2224542C2 |
Способ получения экстракта, обладающего иммуномодулирующим действием, из животного сырья | 1984 |
|
SU1442064A3 |
Способ получения вакцины ассоциированной против колибактериоза, стрептококкоза и энтерококковой инфекции телят и поросят | 2017 |
|
RU2650628C1 |
СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ АССОЦИИРОВАННОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ КОЛИБАКТЕРИОЗА, СТРЕПТОКОККОЗА И ЭНТЕРОКОККОВОЙ ИНФЕКЦИИ ТЕЛЯТ И ПОРОСЯТ | 2010 |
|
RU2429012C1 |
СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ВАКЦИНЫ, АССОЦИИРОВАННОЙ ПРОТИВ ЭШЕРИХИОЗА, СТРЕПТОКОККОЗА И СТАФИЛОКОККОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА | 2013 |
|
RU2538158C1 |
ПРОТИВОМИКРОБНОЕ СРЕДСТВО | 2014 |
|
RU2556509C2 |
Способ получения поликомпонентной вакцины на основе антигенов условно-патогенных микроорганизмов | 2022 |
|
RU2799527C1 |
Способ профилактики острых кишечных заболеваний у поросят | 2017 |
|
RU2649831C1 |
Способ получения производных гликолипидов,стимулирующих регенерацию клеток и тканей (его варианты) | 1983 |
|
SU1396958A3 |
Изобретение относится к области медицинской микробиологии, в частности к получению лечебных вакцин. Сущность способа сводится к тому, что десять уропатогенных штаммов, вьщелеиных от больных,«в число которых входит 6 штаммов Е. coli и по 1-му штамму К1. pneumoniae, Р. mor- ganis, P. mirobilis и S. faecalis, раздельно культивирзтот в жвдкой или на плотной питательной среде, полученные биомассы инактивируют различ- . ньми способами (тепловая обработка, J-облучение или химическая обработка). Затем обработанные биомассы смешивают до конечной концентрации 2- 10 клеток/мл. Смесь бактерий сорбируют на фосфате алюминия при концен-. трации последнего 1,5-10 мг/мл вакцины. Для сохранения свойств вакцины добавляют тиомерсаль и при необходимости лиофилизируют. 9 табл. СО
Подвижность Рост в KCN-среде Цитрат как С-источник
Газообразный углевод глюкозы
Кислота лактозы сахарозы мальтозы маннита треалозы ксилозы
Желатиновый гидролиз Индол Уреаза
Hj,S TS1
(тройной агар сахара- железа)
Лизиндегидрокарбокс шаза
+
- (d)
+ (d)
+ +
(d)
+ +
1452462
Ферментация углеводов
10 Таблица 2
Штамм Escherichia coli
Опыт
455 ив 525 UB 560 UB 616 UB j 654 UB I 719 UB
ро
ечай
О
О О
О
О О
I- + О О + +
о о
+
о
+
о о
о
о
о
и е: + - положительная за 24 ч;
О - отрицательная после 72 ч.
Таблица 4 Ферментация углеводов
О
о о
о
о
о
о о
+
о
+
Галактоза
Сорбит
Арабиноза
Глюкоза
Манноза
Фруктоза
Адонит (рибит)
примечание : + - кислота.
Таблица 5
Мочевина
Гемолиз на пластинах крови с агаром
Желатиновыйгццролиз
Цитрат Индол
H,S
о о
О О + О
о о
+ О О
О
о
15
Подвижность
о
ечание: + - положительная за 24 ч; О -отрицательная после 72 ч.
Таблица Ферментация углеводов
Лактоза
Сахароза
Маннит Мальтоза
Мелибио- за
Рафиноза
Раьшоза
Треалоза
Салицин
Рибоза
Амигда- лин
Галактоза
Сорбит
Араби- ноза
Глюкоза Манкоза
Фруктоза
Адонит (рибит)
Инозит Дульцит
1452462
Продолжение табл.5
16
+ +
О О
+ + + +
+ +
о
+ +
о
о о
17
Целлоби- оза
Ксилоза
Примечание: + - кислота„
Таблица 7
Опыт
Мочевина Тип гемолиза
Желатиновый гидролиз
Восстановление лакмусового молока
Индол
Эскулин
Рост на питательной
40% желчи
6,5% хлористого
натриярН 9,6 Теплостойкость
60 С в течение
30 мин
Примечание: + О
I
1452462 18
Продолжение табл.б
+ О
Streptococcus faeca- lis 676
О Негемолитический
О
положительный;
отрицательный.
не определен
19
145246220
Таблица 9
Аналогов в патентной и научно- технической литературе не обнаружено, |
Авторы
Даты
1989-01-15—Публикация
1985-08-30—Подача