Способ получения производных гликолипидов,стимулирующих регенерацию клеток и тканей (его варианты) Советский патент 1988 года по МПК A61K35/14 

со

СО О5

со ел

00

Изобретение предназначено для получения соединений, ускоряющих заживление ран. Цель изобретения - повышение выхода целевого.продукта. После обработки этанолом и бактерк- остатиком кровь подвергают автолизу. Надосадочную жидкость подвергают диализу. Противодиализат вьюушивают и растворянзт в смеси тетрагидрофурана и хлористого калия. В прозрачный раствор после упаривания добавляют смесь хлороформа и метанола. Верхнняо фазу упаривают досуха. Сухой остаток растворяют в смеси хлороформа, метанола и воды. Колонку промьюают и злюируют из нее гликопипид смесью хлороформа, метанола и воды. Благодаря применению очищенного соединения ускоряется заживление ран на ранней стадии образования стромы и базаль- ного слоя с капиллярами. 4 с.п. ф-лы. со

см

Изобретение относится к медицине, в частности к способам получения соединений, ускоряющих заживление ран,

Цель изобретения - повышение выхода целевого продукта.

П р и м е р 1.

а. 2л полученной из убойных теля крови тут же на бойне смешивают с 300 МП этанола и обрабатывают бакте- риостатиком - метиловым эфиром п-ок- сибензойной кислоты (метилпарабен) и н-пропиловым эфиром п-оксибензой- ной кислоты (пропил-парабен) до концентрации каждого из них 0,02%. Обработанную таким образом кровь подвегают автолизу в течение трех дней при комнатной температуре. При этом происходит сильный гемолиз и частичное разложение неустойчивых компонен тон, а также растворение проходящих через мембрану компонентов. Полученный автолизат отделяют от осадка декантацией, а надосадочную жидкость

подвергают в течение трех дней диали-25 жания исходного материала.

зу через мембрану, не пропускающую соединения с молекулярным весом более 10000, статическим или динамическим способом. В случае динамического диализа диализат и противодиа- лизат в течение трех дней перекачивают через мембрану насосом, чтобы поддерживался максимальный градиент концентраций. При этом процессе кровь одновременно автолизуют и полученные продукты автолиза могут непрерывно диффундировать через диализную мембрану. Чтобы в каждый момент времени правильно поддерживать оптимальный уровень концентрации, проходящий автолиз осуществляют противотоком.

Образующийся противодиализат или фильтрат имеет содержание сухого вещества 5-80 мг/мп. Содержание в нем способствующих заживлению ран соединений доходит до 1 мг/мп (по извест- ному способу получают продукт с содержанием гликосфинголипидов 0,005 мг/мл)

б. Фильтрат смешивают с 6 л смеси этанола и эфира в соотношении 3:1. При этом происходит вьвдавлива- ние осадка,, содержащего главным образом гликосфинголипиды.-Осадок подвергают центрифугированию в центрифуге с ускорением 18000 g в течение 30 мин и отделяют от жидкой фазы.

Полученный осадок высушивают в вакууме при , после чего растворяют в 20 мл смеси хлороформа и мета

нола в соотношении 65:35. Растворенные гликосфинголипиды пропускают через заполненную флорисилом (торговое название геля силиката мaгfшя высокоселективного адсорбента фирмы Flori- din Corp Питтсбург, штат Пенсильвания, США) колонку диаметром 5,0 и высотой 40 см с использованием в качестве подвижной фазы смеси хлороформа и метанола в соотношении 65:35, в результате чего из него удаляются остатки фосфолипидов. Гликосфинголипиды элю- ируют из колонки последовательно смесями хлороформа и метанола по 2 л с содержанием метанола 35, 50, 75% и, наконец, 100%-ным метанолом. Получаемые на отдельных стадиях элюирова- ния соединения испытывали на способность заживлять раны. При этом оказалось, что содержащиеся в последней, элюируемой 100%-ным метанолом, фракции соединения ускоряют заживление ран. Выход составляет 18% от содер30

35

0

0

5

Содержащиеся в этой фракции соединения наносят на препаративные пластины для тонкослойной хроматографии с покрытием из силикагеля тол- 2 мм. Восходящую хроматографию проводят с использованием в качестве подвижной фазы смеси хлороформа, метанола и О,1%-ного водного раствора хлористого кальция в соотношении 55:45:10. Расстояние - 18 см, После хроматографии пластины высушивают и ненадолго помещают в камеру с атмосферой, насыщенной парами йода. Окрашиваемые при этом в желтый цвет зоны отмечают, после сублимации йода, соскребают с пластины силикагель и проводят элюирование смесью хлороформа и метанола в соотношении 50:50. В опытах по ускоряющему действию на заживление ожоговых ран у крыс положительные результаты получены при использовании фракции со значением Rr при разделении указанным методом тонкослойной хроматографии, равным 0,65. I

Пример 2.2л противодиализата, полученного по примеру 1а, высушивают в ротационном выпарном аппарате или с помощью лиофилизации и растворяют в 4 л смеси тетрагидрофзфана и 0,01 М раствора КС1 в соотношении 4:1. Нерастворимый остаток отфильтровывают на бумажном фильтре, а про- зрачньй раствор упаривают в ротационном вьтарном аппарате до объема

500 МП, добавляют к нему 1 л смеси хлороформа и метанола в соотношении 2:1 и органическую и водную фазы разделяют путем добавления к смеси 200 мл воды. Верхнюю фазу, содержащую гли- колипиды, отделяют и упаривают досуха. Сухой остаток растворяют в 10 мл смеси хлороформа, метанола и воды в

соотношении 90:10:0,2. Колонку промы-io в соотношении 9:1 и отбрасывают эти

вают 1,5 л смеси того же состава, после чего элюируют из нее гликолипид в 1 л смеси хлороформа, метанола и воды в соотношении 85:15:0,2. Выход

составляет 21% от содержания исход- 15 Форме. Выход составляет 41% от содерного материала, RC 0,65. Получаемое зтим способом очищенное соединение представляет собой гликолипид, ускоряющий заживление ожоговых ран.

Пример 3,2л противодиали-

зата, полученного по примеру 1а, экстрагируют описанным в примере 16 образом смесью этанола и эфира в соотношении 3:1 и осадок растворяЕот в 20 мл смеси хлороформа и метанола в соотношении 2:8. Диэтиламиноэтил- сефадекс А50 в С1-форме путем промывки О, 1 н. раствором едкого натра и 1 и. раствором уксусной кислоты переводят в ацетатную форму, промы- вакгг метанолом и заполняют им колонку диаметром 2,5 и высотой 20 см. Растворенный в смеси хлороформа и метанола в соотношений 2:8 продукт перено

сят в колонку и промывают ее последо- - ламинарным потоком постоянно удаля- вательно порциями по 200 мл 0,001,ются продукты гидроли.за, которые прошли через мембрану.

Результатом этого является то, что к каждому моменту времени создается оптимальный перепад концентра0,002 и 0,2 М ацетата натрия. После этого гликолипид элюируют смесью хлороформа и метанола в соотношении 2:8, Выход составляет 48% от содержания

4Q

исходного материала, Rr 0,65, Элю- ируемый таким образом гликолипид ускоряет заживление ожоговых ран.

Пример 4, Противодиализат примера 1а смешивают с 9 объемами этанола и перемешивают смесь в течение 30 мин при 85 С, Выпадающий при этом осадок отфильтровывают через бумажный фильтр, а прозрачный раствор вьщерживают в течение 3 дней,при температуре 20°С. Выпадающий осадок целевого соединения за это время оседает. Надосадочную жидкость отделяют декантацией, а остаток растворяют в смеси хлороформа и метанола в соотношении 2:1 и переносят раствор в колонку, заполненную модифицированным диэтиламиноэтиловым сефацелем )в ацетатной форме, Элюирование проводят

смесью хлороформа и метанола в соотношении 2:1, Элюант собирают, упаривают в ротационном выпарном аппарате и растворяют в хлороформе. Раствор переносят в колонку, заполненную активированным углем в хлороформе. Колонку промывают вначале хлороформом, затем смесью хлороформа и метанола

элюаты. После этого колонку промывают смесью ацетона и метанола в соотношении 9:1, В зтой фракции содержится целевой гликолипид в чистой

жания исходного материала, RfS 0,65,

Благодаря применению автолиза и диализа выход гликолипидов в значительной степени увеличивается (до 1 мг/мл по сравнению с 0,005 мг/мл).

Кроме того, используется только одно хроматографическое вьделение в то время как по известному способу требуется три хроматографических вы- деления.

Если автолиз и диализ проводятся одновременно и непрерывно методом противотока, то эффективность способа в дальнейшем увеличивается, Благодаря диализу методом противотока у автолизата постоянно забираются низкомолекулярные продукты гидролиза, так как на другой стороне мембраны, т,е, на стороне диализата,

4Q

ции продуктов гидролиза между стороной диализа и автолиза мембраны. Удаление этих продуктов приводит далее к тому, что гидролиз на стороне авто- ли за мембраны не может достичь равновесия и в соответствии с этим дает полный гидролиз целевого продукта, что при статической ультрафильтрации или статическом диализе невозможно, так как здесь достигается равновесие, при котором количество целевого продукта и гидролизата константно, С помощью фармакологических опытов было показано, что полученные активные вещества способствуют пролиферации предварительно поврежденньк фи- бробластов in vitro и, кроме того, способствуют регенерации соответствующих клеточных популяций in vivo

В данном случае речь идет не об обычных соединениях, оказывающих митоти- ческое действие, поскольку при добавке упомянутых соединений к обычным здоровым клеточным культурам не происходит никаких изменений,а культуры с нормально низкой степенью деления, вызванной добавкой к ним вредных агентов, после добавки к ним указанных соединений в течение короткого времени вновь восстанавливают свои функции в отношегщи степени деления, которые практически идентичны соответствующей функции здоровой культуры.

С учетом того факта, что восстановительные механизмы клеточных популяций как in vitro, так и in vivo стимулируются соединениями, получав- мыми предлагаемым способом, последние можно рекомендовать для терапевтического применения, в частности при лечении медленно или плохо зажив лякнцихся ран или ульцераций, восста- новительные способности которых ограничены. Благоприятное действие зтих соединений на исцеление ран иллюстрируется следующими опытами на животны

Опьп 1. Наркотизированным крысам сбривают шерсть и с обеих сторон те- -ла вызывают ожоговые ранения прикладванием к оголенной коже на 30 с латунных дисков диаметром 2 см, нагретых до 270°С. Активное вещество вводят в железообразную основу. В результате получают мазь с 20%-ным содержанием активного вещества. Для сравнения готовят контрольную мазь путем введения в желе, воды или физиологического раствора поваренной соли. Двум партиям подопытных животных (по 10 животных в каждой партии) ежедневно (по два раза в день) обрабатывают раны мазью до полного выздоров- ления. В случае соединения ,описанного в примере 2, со значением R 0,65 время излечения по сравнению с контрольной группой сокращается, причем это сокращение может доходить до 21%. .

Опыт 2. Наркотизированным крысам наносят путем штампования раны шириной 1 см и глубиной 5 мм. В отверстия раны вводят полые циливдры с вискозно-целлюлозной губкой. Во внутреннюю полость цилиндрической трубки ежедневно вводят по 100 мкл очищенного соединения. Через 4, 10, 16 и 2

день после начала имплантаиии губку извлекают и анализируют на содержани гемоглобина, дезоксирибонуклейновой кислоты и оксипиролина. Содержание указанных соединений в имплантированных губках, извлеченных из ран через 4 и 10 дней после начала введения чистых соединений, было не выше, чем в губках, извлеченных из ран контролных животных. Однако через 16 и 21 день содержание в губках гемоглобина дезоксирибонуклеиновой кислоты и оксипиролина было значительно вьш1е.

Благодаря очищенному соединению в соответствии с примерами 1-4 ускоряется заживление ран на.ранней стадии образования стромы и базального слоя с капиллярами.

Опыт 3. Рост клеточных культур, например растущих фибробластов, можно затормозить, убрав из питательной среды карбонат натрия. Добавка к питательной среде описанных в примерах 1-4 соединений приводит к тому, что клетки быстрее восстана1вливают свои функции. Нормальная скорость деления у них достигается быстрее, чем у та- КИМ же образом заторможенных, но не подвергнутых дополнительной обработке клеточных культур.

Формула изобретения

ции метанола, а в качестве подвижной фазы при хроматографии активной фракции используют смесь хлороформа, метанола и водного раствора хлористого кальция в соотношении 55:45:10.

и метанола в соотношении 2:1, разделяют на органическую и водную фазы, добавляя воду, отделяют надосадочную органическую фазу с последующей ее сушкой и растворением в смеси хлороформа, метанола и воды в соотношении 90:10:0,2, а хроматографию проводят на колонке Bio-Sil-А с той же смесью растворителей.

Редактор М. Петрова

10

20

25

при этом автолизат и противодиализат непрерывно перекачивают насосом в противотоке или автолизат отделяют декантацией от осадка с последующим диализом надосадочной жидкости, смешивают противодиализат с 9 объемами этанола и перемешивают при ,фильтруют и фильтрат вьщерживают в течение 3 дней при 20 С, надосадочную жидкость отделяют декантацией и остаток растворяют в смеси хлороформа и метанола в соотношении 2:1, а хроматографию проводят в колонке, запол- 5 ненной модифицированным дизтиламино- этиловым сефацелем в ацетатной форме с той же смесью растворителей, после чего осуществляют злюирование смесью хлороформа с метанолом в соотношении 9:1 и затем смесью ацетона с метанолом в том же соотношении.

4, Способ получения производных гликолипидов, стимулирукщих регенерацию клеток и тканей, путем вьщеле- ния активного начала из крови теленка с последующей хроматографией, отличающийся тем, что, с целью по- вьш1ения выхода целевого продукта, вьщеление проводят путем автолиза крови в течение 3 дней при комнатной температуре и диализа через мембрану с пределом растворения 10000,относительно водно-спиртовой среды, при этом диализат и противодиализат непрерывно перекачивают при помощи насоса в противотоке или aвтoл зaт отделяют декантацией от осадка с последукмцей даализахщей надосадочной жидкости, затем к противодиализу добавляют смесь этанола с эфиром в соотношении 3:1, полученный осадок отделяют центрифугированием при 18000 g в течение 30 мин, высушивают и растворяют смесью хлороформа и метанола в соотно-. шении 2:8, а хроматографию раствора проводят на колонке, заполненной ди- этиламиноэтил-сефадексом А50 в ацетатной форме, и элюцию осуществляют смесью хлороформа и метанс(ла в соотношении 2:8.

Составитель Л. Шилина

Техред Л.Сердюкова Корректор А.Обручар

30

35

40

45

50

10

5

20

5

25

30

35

40

45

50