Способ получения экстракта, обладающего иммуномодулирующим действием, из животного сырья Советский патент 1988 года по МПК A61K38/22 

4 4;:

ю

о о: 4

Изобретение относится к медицине, точнее к способам получения ле- , карственных средств. Цель изобретения - упрощение технологического про-, цесса. Для этого порцию тимуса теленка измельчают до кашицы, к ней добавляют апирогенную бидистиллированную воду и в проточном нагревателе осаждают высокомолекулярные составные части 10 мин при . Затем кашицу охлаждают и центрифугируют. К над- осадку добавляют для непрерывной ультрафильтрации апирогенную воду. Ультрафильтрат подвергают электродиализу 2 ч при , напряжении 12 В, максимальной силе тока АО А. Выход экстракта составляет 1,6-1,54%., §

см

Изобретение относится к медицине а именно к способам получения лекарственных средств.

Цель - упрощение технологического процесса.

Пример 1.5 кг тимуса теленка, освобожденного от жировых тканей и хранящегося при температуре - измельчали в мясорубку до кашицы. К кашице добавили 5 л апирогенной, би- дистиллированной воды и в проточном нагревателе осаждали высокомолекулярные составные части в течение 10 мин при 80°С. После этого кашицу охлаждают и центрифугируит. К над- осадку добавляют для непрерывной ультрафильтрации еще 10 л апироген- ной воды (поверхность мембраны 2,5м РМ-10 система Ромикон HF 1/35).Ульт- рафнльтрат, вьшаренный до объема 1 л, подвергают электродиализу при полно поверхности мембраны 444 см в течение 2 ч при постоянной температуре , напряжении 12 В, максимальной силе тока 40 А. Выход экстракта равен 58 г (1,16%).

Пример 2. 250 кг свежих селезенок здоровых телят (жировая ткань удалена)„ Замороженные куски гомогенизировали в волчке для мяса. Полученную кашицу нагревали с 250 л апи- рогенной воды в непрерывном нагревателе (длина трубки 20 м) в течение 5 мин до , затем охлаждали в непрерывном охладителе в течение 6 мин до . Центрифугировали. Надосадок подвергли i ультрафильтрации непрерывно при добавлении 900 л апирогенной воды (м.в, 000 даль- тон) . Ультрафильтрат испарили в циркуляционном испарителе и после этого стерилизовали. Концентрат селезенки порциями по 5 л подвергали электродиализу при поверхности мембраны 1776 см, постоянной температуре 37 С, постоянном напряжении 50 В, максимальной силе тока 45 А в течение 3 ч. Проведение способа осуществили в закрытой системе. Выход 3850 г (1,54%).

П р и м е р 3. Эпителиальные клетки эмбриональных точек теленка (FKNE) культивируют в подвижных бутылях до 850 мл с минимальной эссенциальной средой и 7% эмбриональной сыворотки теленка. Незадолго до образования закрытого клеточного покрова, последний промьгеают раствором поваренной

0

5

0

5

0

5

0

5

0

5

соли (рН 7,2) и освобождают из подвижных бутьшей с помощью этиленди- аминтетраацетата воды, а также резинового скребка и помещают в 4 л би- дистиллированной апирогенной воды. Клетки FKNE (410 (мл) растворяют и размельчают в 100 мл порций ультразвуком ( Сонипреп 150 : амплитуда 4, средняя частотаув течение 1 мин. Клеточную массу FKNE нагревают с 4 л воды в проточном нагревателе,до температуры 80 С и через 10 мин охлаждают до температуры 10 С. Денатурированные белки и другие нерастворимые клеточные вещества отделяют путем центрифугирования в Sorvall-центри- фуге с проточным ротором TZ - 28 (20000 об/мин, длительность обработки 10 мин). Затем надосадочную жидкость непрерывно подвергают ультрафильтрации с 8 л бидистшшированной и апирогенной воды (граница м.в. 10 000).

Ультрафильтрат концентрируют до 500 мл и подвергают электродиализу. Выход 55 мг на 100 мл культуры (0,67%) .

П р и м е р 4. Сыворотка крови теленка.

К 6 л сыворотки из свежей крови теленка подают 3 л свободной от пи- рогенов воды. Эту суспензию нагревают в проточном нагревателе до температуры 75°С, выдерживают в течение 5 мин при одинаковой температуре и затем охлаждают в подобной системе трубы до 4°С. Осажденные вещества отделяют путем центрифугирования. Надосадочную жидкость объемом 5,5 л непрерывно подвергают ультрафильтрации путем подачи 15 л свободной от пирогенов воды (м.в. 10 ОООдальтон), После значительного удаления солей при помощи электродиализа получают стерильный и свободный от пирогенов раствор. Этот низкомолекулярный экстракт сыворотки способствует нормализации пол иферации в фибробластах, обратимо поврежденных в культуре,

П р и м е р 5, Свежая кровь теленка,

5 л

шивают воды в

свежей крови теленка переме- с 5 л свободной от пирогенов проточном нагревателе до температуры Ь(,) С. Через 3 мин постоянной температуры суспензию охлаждают в проточном охладителе до 4°С и удаляют осажденные продукты путем центрифугирования. Надосадочную жидкость объемом 6 л подвергают непрерывной ультрафильтрации подачей 18 л свободной от пирогенов воды (м.в. 10 000 дальтон). После значительного удаления солей путем электродиализа полу- .чают стерильный ,свободный от пирогенов раствор. Полученный, таким образом, низкомолекулярный экстракт из крови теленка способствует нормализации пролиферации в фибробластах, обратимо поврежденных в культуре.

П р и м е р 6. Дефибринированная кровь теленка.

5,1 кг дефибрированной крови теленка нагревают с 5 л свободной от пирогенов воды в проточном нагревателе до температуры 80°С и выдерживают в течение 5 мин при одинаково высокой температуре. Затем кашицу охлаждают в проточном охладителе до температуры 4 С и удаляют осажденные вещества помощи центрифугирования. Надосадочную жидкость объемом 7 л непрерьгано подвергают ультрафильтрации подачей 18 л свободной от пирогенов воды (м.в. ; 10 ПСО даль- тон) . После осуществления электродиализа получают обедненный солями, стерильньй и свободный от пирогенов концентрированный раствор. Раствор способствует нормализации полиферации в фибробластах, обратимо поврежденных в культуре.

Пример. Спинной мозг теленка.

Из костей позвонка свежезаколотого здорового теленка изолируют 5 кг мозга и нагревают с 5 л свободной от пирогенов воды в проточном нагревателе до температуры 80°С и выдеривают в течение 5 мин в постоянной температуре. Затем кашицу охлаждают в

ы

1/3 объема, как Надосадочную жид- ость, используют непосредственно для следующей ступени. 3 л подвергают льтрафильтрации с 9 л свободной от пирогенов воды (м.в. : дальтон) Из концентрата путем, электродиализа вьщеляют ионы соли. Обедненный солями раствор был стерильный и свободным от пирогенов. Он способствовал нормализации пролиферации в фибробластах, обратимо поврежденных

проточном охладителе до температу- с. После центрифугирования

В культуре и

повышению активности

предельной дезокситрасферазы в клет- ках костного мозга.

Пример8. Мозг из бедренных костей.

Кашицу из 3,5 кг мозгов и из 30кг бедренных костей свежезаколотых телят нагревают с 5 л свободной от пирогенов воды в проточном нагревателе

0 до температуры . Полученную суспензию выдерживают в течение 5 мин. После охлаждения в проточном охладителе застывший жир отделяют от оставшегося раствора. После центрифугиро5 вания обезжиренного раствора надоса- дочную жидкость объемом 5 л непрерывно подвергают ультрафильтрации подачей 15 л свободной от пирогенов воды (м.в. 10 000 дальтон). Из концентри0 рованного препарата путем злектроди- ализа вьщеляют ионы соли. Обедненный солями раствор является стерильным и свободным от пирогенов. Раствор способствует нормализации пролифера5 ции в фибробластах, обратимо поврежденных в культуре, и повышению активности предельной дезокситрансферазы. П р и м е р 9. Плацента овцы.- 4,700 кг кашицы из сильнозаморо0 женных розеток свежей плаценты овцы нагревают с 5 л свободной от пирогенов воды в проточном нагревателе до температуры 80°С и вьщерживают в течение 5 мин в процессе циркуляции.

35

После охлаждения до температуры 4 С

40

отделяют вещества, выпавшие в осадок путем центрифугирования и надосадрч- ную жидкость объемом 7 л подвергают ультрафильтрации непрерывно при подаче 10 л свободной от пирогенов воды (м.в. . 10 000 дальтон). Полученный путем электродиализа обеднённый слоями раствор был стерильным и свободным от пирогенов. Раствор способ- 4g ствовал нормализации пролиферации в фибробластах, обратимо поврежденных в культуре.

П р и м е р 10. Тимоциты. 10 кг свежих органов зобной железы теленка растирают с 10 л раствора поваренной соли (рН 7,2) с фосфатными буферными свойствами в мелкоячеистом сите резиновой пробкой. Вследствие этого из тканей органов отделяют

50

ТИМОЦИТЫ, оставшиеся тканей выбрасывают. Затем тимоциты дважды промьтают раствором поваренной соли с фосфатными буферными свойствами и затем помещают в 10 л бидистиллированной, свободной от пирогенов воды . (1810 клеток/мл). Тимоциты растворяют и размельчают 100 мл порциями ультразвуком (Сонипреп 150 : Амплитуда 4, средняя частота) в течение 1 мин. Кашицу из тимоцитов нагревают с 10 л бидистиллированной свободной от пирогенов воды в проточном нагревателе до температуры и через 10 мин снова охлаждают до температуры . Денатурированные белки и другие нерастворимые клеточные вещества отделяют путем центрифугирования в Sorvall-центрифуге с проточным ротором TZ-28 (20 000 об/мин, длительность обработки 10 мин). Затем надосадочную жидкость непрерывно подвергают ультрафильтрации еще с 20 л бидистиллированной, свободной от пирогенов воды (Граница растворения м.л. 710 000), Ультрафильтрат концентрируют до 2 000 мл и подвергают электродиализу. Продукт, содержащий пептиды, проявляет в СО поврежденных фибробластах активность, стимулирующую рост.

Пример 11. Культура фиброб ластов.

Человеческие кожные фибробласты (клеточная линия CCL-1222) культивируют во вращающихся бутылочках объемом 850 мл со средой RPMI и 10% внутриутробной телячьей сьгооротки. От связанного слоя клеток отделяют сред и клеточный слой обмьгеают два раза раствором поваренной соли, имеющей кислотность рН 7,2.

Клетки отделяют с помощью резинового шибера со стен бутылок и помещают в 0,5 мл воды на квадратный сантиметр, всего в 4 л воды. Порциями в

U42064

5

0

100 мл еще интактные клетки закрывают и размельчают в течение 1,5 мин с помощью ультразвука (Сонипреп-150, амплитуда 4, средняя частота).

Кашицу из клеток быстро нагревают в следующих 4 л воды до 90°С и спустя 3 мин снова охлаждают до 4 С, Денатурированные протеины и фрагменты клеток отделяют с помощью Sorvall- центрифуги с ротором ТЦ-28 (20000 об/мин, время 10 мин). Ультрафильтрованную выстоявшуюся жидкость (предельная величина м.в. 10000) ют до 500 мл. Часть солей удаляют с помощью электродиализа. Содержащий малое количество солей клеточный экстракт оказывается не пирогенетичес- ким и вызывает при обратимых поврежденных фибробластах быструю нормализацию пролиферации.

Формула изобретения

и отделением солей, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа, удаляют белки с молекулярной массой выше 10000 даль- тон, а отделение солей проводят электродиализом при 30-40 С.

5

0

5