Способ определения нарушения функционального состояния мембран кардиомиоцитов Советский патент 1992 года по МПК G01N33/483 

Изобретение относится к экспериментальной медицине и может быть использовано для выявления нарушений и повреждений мембран кардиомиоцитовпод действием экстремальных факторов, а также скрининге фармакологических препаратов.

Известен способ оценки функционального состояния мембран кардиомиоцитов, основанный на комплексном исследовании, а именно выявлении нарушений структуры сарколеммы, определении активности мем- браносвязанной Na, К. АТФазы, а также нарушении результатов их деятельности- - накопления Са в цитозоле кардиомицитов. Для этого навеску ткани миокарда гомогенизируют для выделения сарколеммальной Фракции фермента, гомогенаты подвергают диференциальному центрифугированию,

фракцию мембран инкубируют с субстратом (АТФ) и исследуют фотоколлориметрически активность Na, К, АТФазы. По накоплению неорганического фосфата, который является продуктом гидролиза АТФ, судят об активности мембраносвязанного фермента, снижение которого является показателем нарушения функционального состояния мембран.

Наиболее близким является способ регистрации активности и термоинактивации Na, К, АТФазы. При этом миокардиальную ткань дважды гомогенизируют, гомогенат фильтруют и суспендируют в среде, содержащей 20 мм имидазола, 20 мм пирофосфа- та натрия, 1 мм ЭДТА и имеющей рН 7,8 и температуру 4°С. Осадок промывают, осаждают и суспендируют в среде хранения. Далее оценивают Na, К. АТФазную активность

2

Ю 00

00 ГчЭ

опытных и контрольных образцов. Оценку функционального состояния мембран проводят путем регистрации изменений активности Na, К, АТФазы в результате определения кинетики ее термоинзктива- ции. Для этого по мере инкубации мембра- носвязанного фермента при 52°С в течение 2 ч исследуют активность Na, К, АТФазы. Возрастание скорости термоинактивации в опытных пробах, по сравнению с контролем, свидетельствуют о повреждении мембранос- вязанного фермента и, следовательно, о нарушении функционального состояния мембран кардиомиоцитов. Однако данная методика неспособна оценить ФС мембран, изменение которого может реализоваться при воздействиях без нарушения конфор- мационной стабильности фермента и изменений кинетики его термоинактивации.

Целью изобретения является повышение точности способа и его упрощение.

Для этого сначала определяют исходную трансмембранную разность потенциалов кардиомиоцитов в питательной среде при температуре 32°С - оптимальной для жизнедеятельности препарата In vitro. Затем препарат помещают в среду с t 3-4°С, инкубируют и повторно измеряют трансмембранную разность потенциалов. Далее препарат возвращают в исходные условия жизнедеятельности и регистрируют динамику восстановления трансмембранной разности потенциалов, по которой устанавливают величину и время ее полумаксимального восстановления. Скорость определяют по формуле

-Ґ

где Де - изменение трансмембранного потенциала за время;

t - время, в течение которого наступает полумаксимальное восстановление потенциала.

Оценку функционального состояния мембран кардиомиоцитов проводят по отношению скорости полумаксимального восстановления опытного к контрольному препарату и при значении полученного отношения 1,0, определяют нарушение фун- кционального состояния мембран кардиомиоцитов.

Пример. Объектом оценки ФС мембран кардиомиоцитов является препарат папиллярной мышцы, выделенный из левого желудочка сердца крысы. Крысу наркотизируют, сердце извлекают, а папиллярную мышцу препарируют в охлажденном до 3- 4°С растворе Кребса-Хензелейта. Для осуществления способа используют мышцы с диаметром 0,5-0,7 мм и длиной не менее S

мм. Препарат помещают в кювету, через которую протекает со скоростью 25-30 мл/мин. раствор Кребса-Хензелейта, имеющий состав, мм: NaC 118; КС 4,8; СаС 1,6;

КН2Р041.2; MgS042.4; NaHC0325,2; глюкоза 11,0. Раствор оксигенируют смесью Оа - 95% и С02 - 5% до насыщения его Оа 500 - 550 мм рт.ст. и установления рН 7,35. Раствор подают в термостатированную при 321

0,1°С кювету, а его избыток возвращают в оксигенератор с помощью непрерывно работающего перистальтического насоса. Фиксированную в кювете папиллярную мышцу, стимулируют надпороговыми прямоугольными импульсами с частотой 1 Гц, После стабилизации деятельности препарата в течение 15 мин осуществляют проведение способа.

Для отведения трансмембранной разности потенциалов используют метод микроэлектродной техники и стеклянные микроэлектроды с диаметром кончика не более 0,5 мкм и собственным сопротивлением 20-30 мОм. Трансмембранные потенциалы подавали на вход усилителя постоянного тока с входным сопротивлением около 20 ГОм и далее на осциллограф.

Трансмебранный потенциал регистрируют до холодовой инкубации при температуре 32°С, в конце холодовой инкубации кардиомиоцитов при 3-4°С и далее непрерывно при реперфузии препаратов в питательной среде с температурой 32°С. По результатам их измерений строят кривую

динамики восстановления Е, рассчитывают скорость его полумаксимального восстановления и вычисляют Е 1/2мвкс, т.е., если Емин - 68 мВ, Емакс - Ю мВ, то Е 1/2макс - Емин Ь Емакс

2

85.5 мВ.

Далее относительно величины Е 1/2макс на оси абсцисс графика определяют границы интервала времени t 0,5 мин, откладывают перпендикуляр на кривую графика, а

от границ выделенного участка кривой - перпендикуляры на ось ординат, то отрезок на оси ординат составит Де за время t. В случае, если Дг будет равна 12 мВ, то скорость полумаксимального восстановления

Ем составит:

Y - Ем- 24 мв/мин. Величина в Е, полученная по кривой переходного процесса восстановления Е отражает данный параметр у интактных

кардиомиоцитов (контроль).

После 5 ч стресса, рассчитанные аналогичным способом переходные параметры восстановления, составляют

ЕМИН - 38 мВ; Емакс - 69 мВ; Е 1/2Макс - 53,5 мВ; Е за 0,5 мин - 1,5 мВ, тогда Y |-9мВ/мин.

Для расчета ИФСИ вычисляют отноше- ние величины VB e (9 мВ/мин) опытного препарата к ее значению в контроле (24 мВ/йин), т.е.

« ТЙвг-А-м .

Таким образом, предлагаемый способ позволяет повысить точность определения нарушения функционального состояния мембран кардиомиоцитов. Способ прост, так как в принципе основан на одном при- еме - измерении Е в течение 1,5-5 мин. Предлагаемый способ может быть широко использован в практике экспериментальных исследований нарушений функционального состояния мембран кардиомиоцитов, а именно изучении патогенеза повреждений и нарушений деятельности мембран кардиомиоцитов, разработки способов профилактики заболеваний сердечно-сосудистой системы, сопровождающихся нарушениями и повреждениями мембран кардиомиоцитов, в поиске эффективных медикаментозных средств, предупреждающих эти нарушения, а также скрининге фармакологических пре

паратов, для выявления и оценки их влияний на мембрану и мембраносвязанную Na, К, АТФазу кардиомиоцитов.

Формула изобретения

Способ определения нарушения функционального состояния мембран кардиомиоцитов путем регистрации изменения активности мембраносвязанного фермента, отличающийся тем, что, с целью повышения точности способа и его упрощения, регистрируют трансмембранный потенциал кардиомиоцитов при 32°С, затем охлаждают препарат до , инкубируют его, вновь измеряют потенциал, возвращают препарат в исходные условия, регистрируют динамику восстановления потенциала, рассчитывают величину скорости v его полумаксимального восстановления по формуле

v - Де /t,

где Де - изменение трансмембранного потенциала за время t;

, t - время, в течение которого наступает полумаксимальное восстановление потенциала,

затем рассчитывают отношение полученного показателя к таковому в контроле и при значении полученного отношения менее 1,0 определяют нарушение функционального состояния мембран кардиомиоцитов.

Использование: экспериментальная медицина. Сущность изобретения: In vitro ре- гестрируют изменения активности мембраносоязанной Na, К, АТФазы, для чего сначала определяют исходную трансмембранную разность потенциалов кардиомио- цитов в питательной среде при температуре, оптимальной для жизнедеятельности преперата; затем hpenapaf помещают в аналогичную питательную среду с температурой 3-4°С, инкубируют в ней в течение 90± 5 мин. Повторно измеряют трансмембранную разность потенциалов, после чего препарат возвращают в исходные условия перфузии, регистрируют динамику восстановления трансмембранной разности потенциалов, по которой устанавливают величину и время ее полумаксимального восстановления. Рассчитывают скорость восстановления трансмембранной разности потенциалов и по ней определяют состо- яние нарушения функции мембраны кардиомицитов.