СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭРИТРОЦИТАРНЫХ МЕМБРАН С СОХРАНЕНИЕМ ИХ МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ ПРИ ДЛИТЕЛЬНОМ ХРАНЕНИИ Российский патент 2011 года по МПК G01N33/49 

Описание патента на изобретение RU2436093C1

Изобретение относится к фундаментальной медицине и может быть использовано при проведении научных исследований, связанных с выделением мембран эритроцитов животных и человека и дальнейшей оценкой их структурных и функциональных свойств, а также активности мембраносвязанных ферментов.

Подавляющее большинство современных лекарственных препаратов действуют через структуры (ионные каналы, рецепторы), локализованные на клеточных мембранных. Фармакологическая доступность этих структур и само их наличие во многом зависит от морфофункционального состояния мембраны. Одним из важных показателей состояния клеточной мембраны является вязкость ее липидного бислоя. В настоящее время для оценки вязкостных характеристик мембран используют флюоресцентные зонды, а в качестве объекта исследования мембраны эритроцитов, получаемые из образцов цельной крови.

Известен способ получения эритроцитарных мембран для исследовательских целей заключается в том, что используют свежую гепаринизированную кровь с последующим гемолизом эритроцитарной массы в 0,4 М трисНС1 с осаждением мембран центрифугированием при 15 000 об/мин [Dodge J.T., Mitchell C., Hanahan. D.J. The Preparation and Chemical Characteristics of Hemoglobin-Free Ghosts of Human Erythrocytes Arch. Biochem. Biophys., 1962, vol.201, P.119-130.].

Данный способ является наиболее близким к заявляемому по технической сущности и достигаемому результату и выбран в качестве прототипа.

Недостатком данного способа является то, что забор крови должен проводиться в непосредственной близости от лаборатории и предполагает непрерывное проведение всех этапов выделения эритроцитарных мембран. Способ не позволяет получать эритроцитарные мембраны для оценки их физико-химических свойств из проб крови пациентов в ходе экспедиционной работы. В связи с этим разработка способа получения эритроцитарных мембран с сохранением их морфофункционального состояния после длительного хранении и пригодных для последующего лабораторного исследования является весьма актуальным.

Задача изобретения - разработать способ получения эритроцитарных мембран человека и животных, позволяющий сохранить у них физико-химические характеристики липидного бислоя, содержание белка и показатели активности ферментов при длительном хранении.

Поставленная задача решается тем, что для получения эритроцитарных мембран используют гемолиз эритроцитарной массы в 0,4 М растворе трисНСl, с осаждением мембран центрифугированием при 15 000 об/мин, отличающийся тем, что для гемолиза используют эритроцитарную массу, которую предварительно инкубируют в равном объеме буфера Кребса-Хензелайта рН 7,5, содержащего 20% ДМСО (диметилсульфоксид), в течение 30 минут при температуре (+4)-(+8)°С, а затем замораживают и хранят при температуре (-20)-(-40)°С. Собственно выделение мембран может быть отложено на срок, необходимый для формирования полного массива исследуемых образцов или доставки образцов в специализированную лабораторию.

Действие способа связано с защитой мембран эритроцитов от хаотичной деструкции в результате заморозки.

Новым в предлагаемом изобретении является обработка эритроцитарной массы равным объемом буфера Кребса-Хензелайта рН 7,5, содержащего 20% ДМСО, в течение 30 минут при температуре (+4)-(+8)°С с последующим замораживанием и хранением, до этапа лабораторного исследования, при температуре (-20)-(-40)°С.

Проведенные нами исследования дали возможность подобрать необходимые условия обработки эритроцитарной массы и режим ее криохранения, обеспечивающие сохранность физико-химических характеристик липидного бислоя эритроцитарных мембран.

Существенные признаки, характеризующие изобретение, проявили в заявляемой совокупности новые свойства, явным образом не вытекающие из уровня техники в данной области и не являющиеся очевидными для специалиста.

Идентичной совокупности признаков не обнаружено при изучении патентной и научно-медицинской литературы.

Данное изобретение может быть использовано при проведении научных исследований, связанных с выделением мембран эритроцитов животных и человека и дальнейшей оценкой их структурных и функциональных свойств, а также активности мембраносвязанных ферментов.

Исходя из вышеизложенного, следует считать предлагаемый способ соответствующим условиям патентоспособности: «Новизна», «Изобретательский уровень», «Промышленная применимость».

Изобретение будет понятно из следующего описания.

Образец свежей гепаринизированной крови центрифугируется 15 мин при 3000 об/мин. Образовавшийся слой плазмы удаляется. К оставшейся в пробирке эритроцитарной массе добавляется равный ей объем буфера Кребса-Хензелайта рН 7,5, содержащего 20% ДМСО. Содержимое пробирки перемешивается путем мягкого покачивания и оставляется на 30 минут при температуре (+4)-(+8)°С. Подготовленные образцы переносятся в холодильник с температурой (-20)-(-40)°С, где они хранятся до момента исследования. Образцы размораживаются при комнатной температуре, после чего проводится гемолиз эритроцитарной массы в 0,4 М трисHCl с осаждением мембран центрифугированием при 15000 об/мин. Выделенные мембраны используются в исследованиях в соответствии с стандартными указаниями.

Пример. У экспериментального животного производили забор крови в пробирку, содержащую гепарин, стандартным методом. Кровь перемешивали со стабилизатором и центрифугировали с целью отделения форменных элементов от плазмы в течение 15 мин при 3000 об/мин. Аккуратно при помощи пипетки удаляли плазму. К эритроцитарному осадку добавляли равный объем буфера Кребса-Хензелайта (рН 7,5), содержащего 20% ДМСО, мягко перемешивали содержимое пробирки и оставляли пробу при температуре (+4)-(+8)0С на 30 мин. Затем пробирку с образцом стабилизированных эритроцитов переносили для хранения в морозильную камеру с температурой (-25)°С. Перед процедурой выделения мембран пробу размораживали при комнатной температуре и центрифугировали 15 мин при 3000 об/мин с последующим удалением надосадочной жидкости. Затем приступали к получению эритроцитарных мембран стандартным методом. Полученный эритроцитарный осадок трижды отмывали 0,145 М NaCl в 10 мМ трис-HCl буфере (рН 7,4). В процессе отмывки эритроциты осаждали центрифугированием при 3000 об/мин в течение 15 мин. К отмытым эритроцитам добавляли двадцатикратный объем гипотонической гемолизирующей среды и пробирку с образцом помещали на 30 минут в ледяную баню. Эритроцитарные мембраны осаждали центрифугированием пробы при 15 000 об/мин в течениеи 20 минут. Полученный осадок эритроцитарных мембран трижды промывали 18 мл промывочной среды и осаждали в центрифуге при 15 000 об/мин в течение 20 минут. Выделенные мембраны для дальнейших исследований разводили в 10 мМ трис-HCl буфере (рН 7,4).

Эффективность предлагаемого способа получения эритроцитарных мембран человека и животных проверена в 20 сравнительных исследованиях (табл.1).

Таблица 1. Показатели общего белка и активность K+/Na+АТФазы мембран эритроцитов Группа Общий белок мг/пробу Активность K+/Na+АТФазы мкмоль Pi/час × мг белка Нативные пробы 8,3±0,7 0,021±0,003 Пробы после криохранения 7,9±0,8 0,026±0,014

Из таблицы видно, что проведенная авторами обработка и последующее криохранение эритроцитарной массы, а также размораживание и выделение эритроцитарных мембран не повлияли на показатель общего белка по сравнению с аналогичными образцами, полученными из незамороженной крови. Также не были выявлены достоверные различия в активности K+/Na+-АТФ-азы, определенной в эритроцитарных мембранах, полученных из нативных эритроцитов и эритроцитов, обработанных нашим способом.

Предлагаемое изобретение позволяет сохранить эритроцитарные мембраны человека или животных при длительном хранении с неизменными физико-химическими характеристиками липидного бислоя, содержания белка и активности ферментов.

Похожие патенты RU2436093C1

название год авторы номер документа
Способ оценки гемолитического действия полимеров, полимерных материалов и изделий из них ин витро в статических условиях 2023
  • Комин Артем Владимирович
  • Лешукова Наталья Сергеевна
  • Дубицкая Антонина Дмитриевна
  • Рыбченко Оксана Ивановна
RU2818010C1
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СКОРОСТИ ОБРАЗОВАНИЯ ПРОДУКТОВ ПЕРЕКИСНОГО ОКИСЛЕНИЯ ЛИПИДОВ В МЕМБРАНАХ ЭРИТРОЦИТОВ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ 2002
  • Василенко Т.Ф.
RU2229133C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РАСТВОРОВ ГЕМОГЛОБИНА, ОЧИЩЕННЫХ ОТ СТРОМАЛЬНЫХ КОМПОНЕНТОВ 2006
  • Кузнецова Нина Петровна
  • Гудкин Лев Романович
  • Мишаева Римма Никодимовна
  • Панарин Евгений Федорович
RU2329826C1
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КИСЛОТНОЙ УСТОЙЧИВОСТИ ЭРИТРОЦИТОВ ХЛАДНОКРОВНЫХ ЖИВОТНЫХ 2014
  • Абдуллаева Наида Муртузалиевна
  • Чалабов Шамиль Исмаилович
RU2571081C1
Вещество, обладающее антикальциевым действием 1989
  • Абышев Азад Зиядович
  • Дьячук Георгий Иванович
  • Вишневецкая Татьяна Петровна
  • Лапкина Галина Яковлевна
  • Лобанов Николай Александрович
  • Семенов Евгений Васильевич
SU1836087A3
Способ определения состояния липидной компоненты мембраны клетки 2019
  • Горохова Виктория Григорьевна
  • Кузнецова Эмма Эфраимовна
RU2717248C1
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОСМОТИЧЕСКОЙ СТОЙКОСТИ ЭРИТРОЦИТОВ 2014
  • Андриенко Алексей Владимирович
  • Бубликов Дмитрий Сергеевич
  • Лычев Валерий Германович
  • Усынин Владимир Валерьевич
RU2580300C1
Способ выявления у микроорганизмов протективного действия на молекулу гемоглобина 2017
  • Черкасов Сергей Викторович
  • Щуплова Елена Алексеевна
  • Гладышева Ирина Вячеславовна
RU2687061C2
Способ оценки пригодности эритроцитарной взвеси для проведения гемотрансфузии 2017
  • Черныш Александр Михайлович
  • Козлова Елена Карловна
  • Мороз Виктор Васильевич
  • Сергунова Виктория Александровна
  • Гудкова Ольга Евгеньевна
RU2647457C1
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЛИКИРОВАННОГО ГЕМОГЛОБИНА В КРОВИ 1993
  • Ковалева Галина Геннадьевна
  • Доценко Ольга Васильевна
  • Власенко Сергей Борисович
  • Староверов Сергей Михайлович
RU2038597C1

Реферат патента 2011 года СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭРИТРОЦИТАРНЫХ МЕМБРАН С СОХРАНЕНИЕМ ИХ МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ ПРИ ДЛИТЕЛЬНОМ ХРАНЕНИИ

Изобретение относится к медицине, в частности к способу получения эритроцитарных мембран. Способ получения эритроцитарных мембран, заключающийся в том, что для гемолиза используют эритроцитарную массу, которую предварительно инкубируют в равном объеме буфера Кребса-Хензелайта рН 7,5, содержащего 20% ДМСО, затем замораживают и хранят при определенных условиях, перед проведением исследований образцы размораживают и проводят гемолиз эритроцитарной массы в 0,4 М растворе трисНСl с осаждением мембран центрифугированием. Эритроцитарные мембраны, полученные вышеописанным способом, сохраняют свое морфофункциональное состояние. 1 табл.

Формула изобретения RU 2 436 093 C1

Способ получения эритроцитарных мембран, заключающийся в гемолизе эритроцитарной массы с последующим осаждением мембран путем центрифугирования, отличающийся тем, что для гемолиза используют эритроцитарную массу, которую предварительно инкубируют в равном объеме буфера Кребса-Хензелайта рН 7,5, содержащего 20% ДМСО, в течение 30 мин при температуре (+4)-(+8)°С, а затем замораживают и хранят при температуре (-20)-(-40)°С, перед проведением исследований образцы размораживают при комнатной температуре и проводят гемолиз эритроцитарной массы в 0,4 М растворе трисНСl с осаждением мембран центрифугированием при 15000 об/мин, в течение 20 мин.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2011 года RU2436093C1

Dodge J.T
et al
The preparation and chemical characteristics of hemoglobin-free chosts of human erythrocytes // Arch
Biochem
Biophys., 1962, p.119-130
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОСТОЯНИЯ МЕМБРАН ЭРИТРОЦИТОВ 2005
  • Кузнецова Эмма Эфраимовна
  • Горохова Виктория Григорьевна
  • Горохов Анатолий Григорьевич
  • Рунович Алексей Анатольевич
RU2296992C1
СПОСОБ ОЦЕНКИ УСТОЙЧИВОСТИ ЭРИТРОЦИТОВ К ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ НАГРУЗКЕ 2008
  • Пивоваров Юрий Иванович
  • Кузнецова Эмма Эфраимовна
  • Горохова Виктория Григорьевна
  • Корякина Лариса Борисовна
  • Курильская Татьяна Эфимовна
  • Рунович Алексей Анатольевич
RU2371723C1

RU 2 436 093 C1

Авторы

Реброва Татьяна Юрьевна

Путрова Олеся Дмитриевна

Афанасьев Сергей Александрович

Попов Сергей Валентинович

Даты

2011-12-10Публикация

2010-03-15Подача