Изобретение относится к фундаментальной медицине и может быть использовано при проведении научных исследований, связанных с выделением мембран эритроцитов животных и человека и дальнейшей оценкой их структурных и функциональных свойств, а также активности мембраносвязанных ферментов.
Подавляющее большинство современных лекарственных препаратов действуют через структуры (ионные каналы, рецепторы), локализованные на клеточных мембранных. Фармакологическая доступность этих структур и само их наличие во многом зависит от морфофункционального состояния мембраны. Одним из важных показателей состояния клеточной мембраны является вязкость ее липидного бислоя. В настоящее время для оценки вязкостных характеристик мембран используют флюоресцентные зонды, а в качестве объекта исследования мембраны эритроцитов, получаемые из образцов цельной крови.
Известен способ получения эритроцитарных мембран для исследовательских целей заключается в том, что используют свежую гепаринизированную кровь с последующим гемолизом эритроцитарной массы в 0,4 М трисНС1 с осаждением мембран центрифугированием при 15 000 об/мин [Dodge J.T., Mitchell C., Hanahan. D.J. The Preparation and Chemical Characteristics of Hemoglobin-Free Ghosts of Human Erythrocytes Arch. Biochem. Biophys., 1962, vol.201, P.119-130.].
Данный способ является наиболее близким к заявляемому по технической сущности и достигаемому результату и выбран в качестве прототипа.
Недостатком данного способа является то, что забор крови должен проводиться в непосредственной близости от лаборатории и предполагает непрерывное проведение всех этапов выделения эритроцитарных мембран. Способ не позволяет получать эритроцитарные мембраны для оценки их физико-химических свойств из проб крови пациентов в ходе экспедиционной работы. В связи с этим разработка способа получения эритроцитарных мембран с сохранением их морфофункционального состояния после длительного хранении и пригодных для последующего лабораторного исследования является весьма актуальным.
Задача изобретения - разработать способ получения эритроцитарных мембран человека и животных, позволяющий сохранить у них физико-химические характеристики липидного бислоя, содержание белка и показатели активности ферментов при длительном хранении.
Поставленная задача решается тем, что для получения эритроцитарных мембран используют гемолиз эритроцитарной массы в 0,4 М растворе трисНСl, с осаждением мембран центрифугированием при 15 000 об/мин, отличающийся тем, что для гемолиза используют эритроцитарную массу, которую предварительно инкубируют в равном объеме буфера Кребса-Хензелайта рН 7,5, содержащего 20% ДМСО (диметилсульфоксид), в течение 30 минут при температуре (+4)-(+8)°С, а затем замораживают и хранят при температуре (-20)-(-40)°С. Собственно выделение мембран может быть отложено на срок, необходимый для формирования полного массива исследуемых образцов или доставки образцов в специализированную лабораторию.
Действие способа связано с защитой мембран эритроцитов от хаотичной деструкции в результате заморозки.
Новым в предлагаемом изобретении является обработка эритроцитарной массы равным объемом буфера Кребса-Хензелайта рН 7,5, содержащего 20% ДМСО, в течение 30 минут при температуре (+4)-(+8)°С с последующим замораживанием и хранением, до этапа лабораторного исследования, при температуре (-20)-(-40)°С.
Проведенные нами исследования дали возможность подобрать необходимые условия обработки эритроцитарной массы и режим ее криохранения, обеспечивающие сохранность физико-химических характеристик липидного бислоя эритроцитарных мембран.
Существенные признаки, характеризующие изобретение, проявили в заявляемой совокупности новые свойства, явным образом не вытекающие из уровня техники в данной области и не являющиеся очевидными для специалиста.
Идентичной совокупности признаков не обнаружено при изучении патентной и научно-медицинской литературы.
Данное изобретение может быть использовано при проведении научных исследований, связанных с выделением мембран эритроцитов животных и человека и дальнейшей оценкой их структурных и функциональных свойств, а также активности мембраносвязанных ферментов.
Исходя из вышеизложенного, следует считать предлагаемый способ соответствующим условиям патентоспособности: «Новизна», «Изобретательский уровень», «Промышленная применимость».
Изобретение будет понятно из следующего описания.
Образец свежей гепаринизированной крови центрифугируется 15 мин при 3000 об/мин. Образовавшийся слой плазмы удаляется. К оставшейся в пробирке эритроцитарной массе добавляется равный ей объем буфера Кребса-Хензелайта рН 7,5, содержащего 20% ДМСО. Содержимое пробирки перемешивается путем мягкого покачивания и оставляется на 30 минут при температуре (+4)-(+8)°С. Подготовленные образцы переносятся в холодильник с температурой (-20)-(-40)°С, где они хранятся до момента исследования. Образцы размораживаются при комнатной температуре, после чего проводится гемолиз эритроцитарной массы в 0,4 М трисHCl с осаждением мембран центрифугированием при 15000 об/мин. Выделенные мембраны используются в исследованиях в соответствии с стандартными указаниями.
Пример. У экспериментального животного производили забор крови в пробирку, содержащую гепарин, стандартным методом. Кровь перемешивали со стабилизатором и центрифугировали с целью отделения форменных элементов от плазмы в течение 15 мин при 3000 об/мин. Аккуратно при помощи пипетки удаляли плазму. К эритроцитарному осадку добавляли равный объем буфера Кребса-Хензелайта (рН 7,5), содержащего 20% ДМСО, мягко перемешивали содержимое пробирки и оставляли пробу при температуре (+4)-(+8)0С на 30 мин. Затем пробирку с образцом стабилизированных эритроцитов переносили для хранения в морозильную камеру с температурой (-25)°С. Перед процедурой выделения мембран пробу размораживали при комнатной температуре и центрифугировали 15 мин при 3000 об/мин с последующим удалением надосадочной жидкости. Затем приступали к получению эритроцитарных мембран стандартным методом. Полученный эритроцитарный осадок трижды отмывали 0,145 М NaCl в 10 мМ трис-HCl буфере (рН 7,4). В процессе отмывки эритроциты осаждали центрифугированием при 3000 об/мин в течение 15 мин. К отмытым эритроцитам добавляли двадцатикратный объем гипотонической гемолизирующей среды и пробирку с образцом помещали на 30 минут в ледяную баню. Эритроцитарные мембраны осаждали центрифугированием пробы при 15 000 об/мин в течениеи 20 минут. Полученный осадок эритроцитарных мембран трижды промывали 18 мл промывочной среды и осаждали в центрифуге при 15 000 об/мин в течение 20 минут. Выделенные мембраны для дальнейших исследований разводили в 10 мМ трис-HCl буфере (рН 7,4).
Эффективность предлагаемого способа получения эритроцитарных мембран человека и животных проверена в 20 сравнительных исследованиях (табл.1).
Из таблицы видно, что проведенная авторами обработка и последующее криохранение эритроцитарной массы, а также размораживание и выделение эритроцитарных мембран не повлияли на показатель общего белка по сравнению с аналогичными образцами, полученными из незамороженной крови. Также не были выявлены достоверные различия в активности K+/Na+-АТФ-азы, определенной в эритроцитарных мембранах, полученных из нативных эритроцитов и эритроцитов, обработанных нашим способом.
Предлагаемое изобретение позволяет сохранить эритроцитарные мембраны человека или животных при длительном хранении с неизменными физико-химическими характеристиками липидного бислоя, содержания белка и активности ферментов.
название | год | авторы | номер документа |
---|---|---|---|
Способ оценки гемолитического действия полимеров, полимерных материалов и изделий из них ин витро в статических условиях | 2023 |
|
RU2818010C1 |
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СКОРОСТИ ОБРАЗОВАНИЯ ПРОДУКТОВ ПЕРЕКИСНОГО ОКИСЛЕНИЯ ЛИПИДОВ В МЕМБРАНАХ ЭРИТРОЦИТОВ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ | 2002 |
|
RU2229133C1 |
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РАСТВОРОВ ГЕМОГЛОБИНА, ОЧИЩЕННЫХ ОТ СТРОМАЛЬНЫХ КОМПОНЕНТОВ | 2006 |
|
RU2329826C1 |
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КИСЛОТНОЙ УСТОЙЧИВОСТИ ЭРИТРОЦИТОВ ХЛАДНОКРОВНЫХ ЖИВОТНЫХ | 2014 |
|
RU2571081C1 |
Вещество, обладающее антикальциевым действием | 1989 |
|
SU1836087A3 |
Способ определения состояния липидной компоненты мембраны клетки | 2019 |
|
RU2717248C1 |
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОСМОТИЧЕСКОЙ СТОЙКОСТИ ЭРИТРОЦИТОВ | 2014 |
|
RU2580300C1 |
Способ выявления у микроорганизмов протективного действия на молекулу гемоглобина | 2017 |
|
RU2687061C2 |
Способ оценки пригодности эритроцитарной взвеси для проведения гемотрансфузии | 2017 |
|
RU2647457C1 |
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЛИКИРОВАННОГО ГЕМОГЛОБИНА В КРОВИ | 1993 |
|
RU2038597C1 |
Изобретение относится к медицине, в частности к способу получения эритроцитарных мембран. Способ получения эритроцитарных мембран, заключающийся в том, что для гемолиза используют эритроцитарную массу, которую предварительно инкубируют в равном объеме буфера Кребса-Хензелайта рН 7,5, содержащего 20% ДМСО, затем замораживают и хранят при определенных условиях, перед проведением исследований образцы размораживают и проводят гемолиз эритроцитарной массы в 0,4 М растворе трисНСl с осаждением мембран центрифугированием. Эритроцитарные мембраны, полученные вышеописанным способом, сохраняют свое морфофункциональное состояние. 1 табл.
Способ получения эритроцитарных мембран, заключающийся в гемолизе эритроцитарной массы с последующим осаждением мембран путем центрифугирования, отличающийся тем, что для гемолиза используют эритроцитарную массу, которую предварительно инкубируют в равном объеме буфера Кребса-Хензелайта рН 7,5, содержащего 20% ДМСО, в течение 30 мин при температуре (+4)-(+8)°С, а затем замораживают и хранят при температуре (-20)-(-40)°С, перед проведением исследований образцы размораживают при комнатной температуре и проводят гемолиз эритроцитарной массы в 0,4 М растворе трисНСl с осаждением мембран центрифугированием при 15000 об/мин, в течение 20 мин.
Dodge J.T | |||
et al | |||
The preparation and chemical characteristics of hemoglobin-free chosts of human erythrocytes // Arch | |||
Biochem | |||
Biophys., 1962, p.119-130 | |||
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОСТОЯНИЯ МЕМБРАН ЭРИТРОЦИТОВ | 2005 |
|
RU2296992C1 |
СПОСОБ ОЦЕНКИ УСТОЙЧИВОСТИ ЭРИТРОЦИТОВ К ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ НАГРУЗКЕ | 2008 |
|
RU2371723C1 |
Авторы
Даты
2011-12-10—Публикация
2010-03-15—Подача