Способ изготовления вирусвакцины против инфекционного ларинготрахеита кур Советский патент 1992 года по МПК A61K39/245 

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и биотехнологии, в частности к способу изготовления вирусвакцины против инфекционного ларинготрахеита (ИЛТ) кур, и может быть использовано в научных и производственных лабораториях, занимающихся изготовлением биопрепаратов.

, Известны способы изготовления вирусвакцины против ИЛТ кур, включающие выращивание вируса в различных системах (культурах клеток и куриных эмбрионах) с последующим сбором .вируссодержащего материала, его стабилизацию и высушивание под вакуумом.

Все вакцины идентичны, так как выращивание вакцинных штаммов проводят по общепринятой методике, используют штаммы и вирусы с биологической активностью (Ю4 °-105 4)ЛД50 или ЭИДбо, при этом в качестве стабилизатора используют стерильное обезжиренное коровье молоко (обрат) в соотношении 1:1. Однако эти вакцины обладают выраженной peaктогенкостью и низкой иммуногенностью.

Известен также способ изготовления сухой вирусвакцины против ИЛТ кур из клона НТ штамма ЦНИИПП, включающий выращивание его на 10-дневных куриных эмбрионах в течение 120 ч, инкубирование при 33,5±0,5°С, охлаждение при +2-6°С в течение 6-12 ч, сбор вирусного материала, его размол на коллоидной мельнице (К 100/0, К 60/S) при роторе, ввинченном до деления 0,1-0,52 в течение 10-12 мин, фильXJ

сл о о

00 GJ

трование через два слоя стерильной марли, смешивание с равным количеством стерильного обезжиренного коровьего молока, замораживание при - 40-50°С в течение 12- 48 ч, высушивание под вакуумом 60-100 мкм в течение 112-114 ч. Вакцина имеет активность 106 5-107 0ЭИД so/мл, применяется только аэрогенно, обладает слабой ре- актогенностью. В процессе хранения в течение 6-9 мес при + 4-6°С инфекционная активность снижается до 1048-10 2 ЭЙД 50/мл.

При изготовлении этой вакцины используют в качестве стабилизирующей защитной среды, при лиофилизации, обезжиренное коровье молоко (обрат) - пищевой продукт, нестандартный компонент. Лиофильное высушивание проводят последующему режиму: предварительное замораживание при - 40-50°С в течение 12-48 ч, полки сублимационной камеры охлаждают до - 40-44°С, затем ампулы с вакциной помещают в камеру. В течение 74 ч температуру полок в камере доводят до 0°С, выдерживая материал в зоне эвтектических температур (- 37-39°С) в течение 50 ч Затем в течение 18ч температуру полок в камере поднимают до + 23°С и удерживают на этом уровне до конца лиофилизации. Температуру конденсатора в процессе лиофилизации поддерживают в пределах 70-75°С, вакуум 60-100 мкм. Весь цикл лиофилизации длится 112-114ч. Длительный процесс лиофилизации влияет на физические показатели (растворимость, относительную влажность) и биологические свойства (активность, им- муногенность, реактогенность). При хранении снижается биологическая активность на 1,5-2,0 Ig ЭИДзо/мл

Технология получения обезжиренного коровьего молока сложная. Она включает получение и сепарирование свежего молока до получения обрата с жирностью не быше 0,1%, стерилизацию при 110°С текучим паром дробно, трижды, каждый раз по 20-40 мин с интервалом 24-ч. Обезжиренное коровье молоко должно иметь величину рН не ниже 6,6, плотность в пределах 1,029-1,034, храниться при температуре 4-6°С не более 1,5 мес. Это не всегда гарантирует его хорошее качество, так как среда нестандартная и имеет различный состав компонентов, который зависит от качества кормов, условий содержания доноров и времени года. Кроме того, использование обезжиренного коровьего молока в качестве защитной среды приводит к удорожанию конечного продукта за счет расходов на содержание доноров, длительную подготовку молока и его хранение.

Цель изобретения - ускорение способа, снижение ареактивности и повышение стабильности при хранении целевого продукта. Поставленная цель достигается тем, что

в качестве стабилизирующей защитной среды вирусвакцины используют не пищевой продукт, а стандартную 10%-ную лактозо- пептонную смесь в соотношении 1:2 к ви- руссодержащему материалу. Такая вакцина

сохраняет биологическую и иммуногенную активность в течение 12 мес хранения при 2-6°С, ареактогенна для цыплят с 15-дневного возраста.

Пример. При изготовлении вирусвакцины против инфекционного ларинготрахе- ита кур используют клон НТ штамма ЦНИ14ПП вируса ИЛТ (регистрационный N 61 в коллекции ВГНКИ) с биологической активностью 10 18-107 0ЭИД50/мл В качестве

стабилизирующей защитной среды высушивания 10% смесь стандартных компонентов лактозы (ТУ 6-09-2293-79) и пептона (ГОСТ 13805-76) отечественного производства, взятых в соотношении 1:1, которую добавляют к вируссодержащему материалу в соотношении 1:2. Затем фасуют при помощи дозатора (АТ-5) в стерильные ампулы по 4 мл или флаконы по 6 мл, лиофилизацию проводят при вакууме 100 мкм, замораживают

при - 48°С в течение 9 ч, затем выдерживают материал при - 30°С в течение 40 ч. после чего доводят температуру до 22°С в течение 16 ч и проводят досушивание.

Это позволило ускорить способ изготовления вирусвакцины, снизить ареактив- ность и повысить стабильность при хранении целевого готового продукта, что подтверждено опытами по Сравнительной оценке вакцины с предлагаемой защитной

средой и режимом лиофилизации, а также с известной (обезжиренным коровьим молоком) и известным режимом лиофилизации. Эти данные приведены в таблице.

Из таблицы видно, что лиофильное высушивание вирусвакцины с обезжиренным коровьим молоком, в качестве защитной среды, в соотношении 1:1 с вирусным сырьем происходит в течение длительного времени 112±2 ч. Отрицательное давление в

процессе сублимационной сушки составляет 90±5 мкм. Замораживание проводят при минус 40±2°С в течение 42±2 ч, выдерживают материал в зоне эвтектической температуры (минус 37±2°С) в течение 50±1 ч.

после чего доводят температуру до плюс 22±1°С в течение 62 ±2 ч и проводят досушивание. Длительный процесс лиофилизации влияет на растворимость (время растворения 4±1 мин), массовую долю влаги (1,2±0,5%), изменяют иммунобиологические свойства препарата (активность снижается на 1,5-2,0 д ЭЙДбО/мл), а это негативно отражается на иммуногенной эффективности препарата. Срок хранения и применения его снижается до 7±2 мес.

При использовании предлагаемой за- щитной среды в виде 10%-ной смеси лактозы и пептона, взятых в соотношении 1:1 и смешанной с вирусным материалом 1:2 сни- жает расход среды вдвое, лиофильное высушивание по предложенному режиму протекает на 60 ч быстрее и стабильнее, это способствует снижению арективности и повышению стабильности при хранении гото- вого продукта. При изготовлении предлагаемой вакцины используется более экономическая, удобная, доступная, стандартная стабилизирующая лактозопептон- ная смесь; исключается из технологии гищевой продукт (молоко); вакцина в предложенном составе арёактогенна, иммуно- генна, легко растворима, имеет хороший вид, сохраняет биологические свойства в течение 12 мес хранения при 2-6°С; при изготовлении вакцины повышается производительность труда в 1,5-2 раза1 снижаются экономические затраты за счет использования стандартной защитной среды и исключения нестандартного пищевого продукта - молока.

Формула изобретения Способ изготовления вирусвакцины против инфекционного ларинготрахеита кур, включающий выращивание вируса инфекционного ларинготрахеита кур штамма ЦНИИПП, его стабилизацию и лиофилиза- цию, отличающийся тем, что, с целью ускорения способа, снижения ареактионо- сти и повышения стабильности при хранении целевого продукта, в качестве стабилизирующей среды используют 10%- ную смесь лактозы и пептона, взятых в соотношении 1:1. которую добавляют к вируссодержащему материалу в соотношении 1:2, лиофилизацию проводят при вакууме 60-150 мкм, замораживание - при минус 45-50°С в течение 8-10 ч, затем выдерживают материал при - 28-32°С в течение 40-45 ч, после чего доводят температуру до плюс 22-23°С в течение 15-18 ч и проводят досушивание.

Препарат

Количество серий

Массовая доля влаги, %

АктивностьUg ЭЙД 50/мя)

Длительность сохранения иммунобиологическихсвойств, нес

Использование: ветеринарная вирусология и биотехнология. Сущность изобретения: при изготовлении вирусвакцины в качестве стабилизирующей защитной среды используют стандартную лактозопеп- тонную смесь в соотношении 1:2 с вирусным материалом и лиофилизируют по предлагаемому режиму в течение 60-65 ч, В отличие от известных эмбриональных вакцин против ИЛТ кур вирусвакцина, полученная по предлагаемому способу, ареактогенна, вы- сокоиммуногенна, более экономична, сохраняет биологическую активность и иммуногенную эффективность в течение 12 мес хранения при 2-6°С. 1 табл.

Вакцина с 10%-ной лактозопептонной смесью в соотношении 1-2 с вирусным материалом

Вакцина с обезжиренным коровьим молоком в соотношении 1:1 с вирусным материалом

toots -45+5 9t1

-30i2 22+t 18±2 60+S

Ш2,5iO,5 7.2+0,2 14+2

сл о о

09 СО

90+5

-40+2 42±2 -37+2 50±1 22±1 62t2

4t1 1,2+0,5 6,3+0,2 712