Способ определения токсичности вод и водных растворов, содержащих активные вещества Советский патент 1992 года по МПК G01N33/18 

Изобретение относится к вопросам экологии, а именно к контролю токсичности воды или водных растворов.

Известны способы определения токсичности воды и водных растворов по воздействию их на живые организмы: на животных (млекопитающие, рыбы, беспозвоночные, простейшие) или на растительные клетки. (1,

2).

Известен способ, заключающийся в воздействии вредных веществ окружающей среды на растительные клетки (протопласты) Vlciafaba, Avenasativa иммобилизованные в матрицу Са-альгината или Za-алыината. Об интенсивности воздействия вредных веществ судят по изменениям биохимическо-физиологических свойств клеток, а именно, определяя этан в 1 м

газовой пробы с помощью этано-газовой хроматографии или по содержании С1402 в ммоль на мг хлорофилла в час с помощью сцинтиляционного счетчика.

Недостатками известного способа являются сложность технологии (получение или культивирование протопластов, приготовление матриц, иммобилизация клеток в матрицы); использование дорогостоящих и дефицитных химических веществ (ферментов, меченых предшественников и т.д.); низкая чувствительность способа.

Цель изобретения - повышение чувствительности способа

Поставленная цель в способе определения токсичности вод и водных ра створов, содержащих биологически активные вещества, путем воздействия исследуемой проVI

сл

Ј сь чэ

бой на растительные клетки с последующей оценкой достигается тем, что воздействие осуществляют путем впсдения части исс ледуемой пробы в межклетники листецов ряски, затем растения выдерживают в исследуемой жидкости в течение 17-18 ч при освещенности 50 ± 4 лк, далее подсчитывают количество эпистрофных хлоропластов до и после ,10-минутной экспозиции светом и оценивают токсичность по увеличению количества эпистрофных хлоропластов,

Пример. Для исследования листецы ряски (Zemna minor Z) инфильтруют различными образцами воды (примеры с 1 по 5) с помощью стеклянного медицинского шприца и ставят на слабый свет (50 ± 4) лк в течение 17-18 ч.

От растений отрывают по одному листе- цу, которые помещают в капле исследуемой жидкости на предметное стекло микроскопа и при 400-кратном увеличении в 10 клетках верхней стороны листеца, в одном.и том же поле зрения.микроскопа подсчитывают число хлоропластов, находящихся благодаря положительному фототаксису у верхней стенки клеток в эпистрофном положении перпендикулярно лучам света, плашмя. Не сдвигая препарата, в микроскопе на 10 мин создают сильное освещение объекта, близкое к максимальному (почти до предела увеличивают накал лампы осветителя).

Через 10 мин освещение объекта уменьшают до удобного предела и в клетках снова подсчитывают количество эпистрофных хлоропластов.

В контроле (водопроводная или дистиллированная вода) число таких хлоропластов обычно приближалось к 0, поскольку большинство хлоропластов переходило в результате отрицательного фототаксиса в парастрофное положение, т.е. прижималось к боковым стенкам клеток, поворачиваясь ребром по отношению к лучам света. Чем сильнее загрязнена вода, тем больше сохранялось в клетках эпистрофных хлоропластов. Процент эпистрофных хлоропластов после 10-минутного воздействия сильного света по отношения к исходному уровню служит показателем повреждения клеток ряски загрязненной водой или водными растениями и,следовательно, показателем токсичности воды или водных растворов. Критерием непосредственного токсического действия на растительную кпетку следует считать достоверное отличие средних показателей (в 10 клетках листецов ряски) 5 опытов (параллелей) от контроля.

В условиях нормы (без действия токсиканта) хлоропласты клеток имеют индивидуальную чуасгвительногл ьфототаксиса, что и отражается в незначительном разбросе количества хлоропластов при их подсчете после короткого действия яркого света

Однако этот показатель всегда достоверно меньше, чем при воздействии токсикантов При определении токсичности веществ в водных растворах критерием токсического действия является также та минимальная

концентрация из излученного ряда, которая еще вызывает достоверное торможение фо тотаксиса по сравнению с контролем

Выбор 10 мин экспозиции связан с тем что в течение этого времени при сильном

освещении хлоропласты контрольных проб перейдут в эпистрофное положение. Это оптимальное время для отрицательного фототаксиса хлоропластов в норме. Превышение этого времени не целесообразно

П р и м е р 1. Определение токсичности сточных вод на входе в очистные сооружения. Подсчет эпистрофных (расположенных плашмя) хлоропластов в 10 клетках листеца ряски сразу после слабого света в течение

17ч дал следующие цифры: 20, 15, 24, 20.18. 21, 17, 24, 25 19. В среднем на клетку 20.3 хлоропласта. После 10-минутного освещения сильным светом подсчет эпистрофных хлоропластов в 10-ти клетках в том же поле

зрения микроскопа дал следующие цифры: 14, 15, 11, 13, 9, О, О, 4, 0. 22. В среднем на клетку 8,8 хлоропласта, что составило в процентах от исходной величины (подсчет после слабого света) 33%. Последняя цифра и

служила показателем интенсивности фототаксиса или степени повреждения клеток.

В контроле (водопроводная вода) были получены следующие данные после слабого света: 24, 13, 17, 28, 16, 16, 17, 18, 26, 23.

В среднем на клетку 19,8 хлоропласта. После 10-минутного освещения сильным светом: 4, 6, О, О, О, О, О, О, 0. 0. В среднем на клетку 1,0 хлоропласт, что составляет 5% от исходной величины,

Данные 5 опытов по определению токсичности входы на входе в очистные сооружения дали следующие средние цифры (в процентах к исходному количеству эпистрофных хлоропластов): 43, 36, 49, 48, 27.

Аналогичные данные для водопроводной воды: 5, 12, 2, 0, 3. М ± м(4 4 ±2,3)%. Достоверность отличия воды до очистки от водопроводной воды 001

Приме р 2. Данные по 5 опытам с водой после очистки перед сбрасыванием в реку Неву (также в процентах к исходному количеству хлоропластов)- 18 16. 26, 12, 18. М ± ±27 Достоверность отличия

от водопроводной воды ,001, достоверность отличия от воды до очистки ,01

П р и м е р 3. Аналогичные данные по 4 опытам с водной фракцией активного ила, после ее двукратного разведения: 66%, 78%, 90%, 100%, М ± м-83,5 ± 10,7. Достоверность большей токсичности водной фракции активного ила (после разведения в 2 раза) по сравнению со сточными водами до очистки: ,01.

П р и м е р 4. Данные по 4 опытам с раствором амфотерицина В (1 мг/л) в процентах к исходному количеству хлоропла- стов: 42, 29, 81, 100. М ± ±17,2. Достоверность отличия от водопроводной воды: ,02.

П р и м е р 5. Данные по действию на фототаксис хлоропластов солей тяжелых металлов (данные по минимальным концентрациям), раствор CuSCM (10 М). Получено в % к исходному количеству хлоропластов: контроль М ± ,1 ± 0.3; опыт М ± м 7.9±2,,05.

Раствор (), получено: контроль М ± ,4 ± 0,5; опыт М ± ,5± ±6; ,001. По известному способу излучали токсичность пентахлорфенола на иммобилизованные протопласты Vicla faba (no определению выделения этана по отношению к контролю). При действии 14 мМ пентахлорфенола продукция этана была увеличена примерно в 2 раза, что и явилось показателем токсичности веществ По изобретению фенол (является менее токсич- ным, чем его хлорпроизводные) при использовании концентрации 7 мМ дал следующие результаты: контроль: 2, 1, 1, 0, 2 (% торможения фототаксиса хлоропластов) М ,34 ±0,2; опыт 8, 47, 15. 53. 76

0 М ,8 ±12; .01.

Таким образом, предлагаемый способ значительно чувствительнее способа по прототипу.

Формула изобретения

5 Способ определения токсичности вод и водных растворов, содержащих биологически активные вещества, путем воздействия исследуемой пробой на растительные клетки с последующей оценкой, отличающий0 с я тем, что, с целью повышения чувствительности способа, воздействие осуществляют путем введения части исследуемой пробы в межклетники листецов ряски, затем растения выдерживают в исследуемой жид5 кости в течение 17-18 ч при освещенности 50+ 4 лк, далее подсчитывают количество эпи- строфных хлоропластов до и после 10-минутной экспозиции светом и оценивают токсичность по увеличению количества эпи0 строфных хлоропластов

Использование экология, контроль токсичности воды и водных растворов Сущность изобретения: определение токсичности осуществляют путем воздействия исследуемых вод и водных растворов на клетки ряски, воздействие на ряску определяют по торможению фототаксиса хлороп- ластов в клетках листецов ряски после инфильтрации проб в межклетники листецов и содержания растений ряски в течение 17-18 ч при освещенности 50 ± 4 лк в исследуемой жидкости Затем подсчитывают количество эпистрофных хлоропластов до и после 10-минутного воздействия света, близкого к максимальному для данного типа микроскопа Отношение оставшихся в эпистрофном положении хлоропластов к исходному уровню служит показателем токсичности воды или водных растворов