Способ определения антител к антигену вируса гепатита дельта Советский патент 1992 года по МПК G01N33/576 G01N33/53 

дельта-антигена из постмортальной ткани печени больных хроническим гепатитом дельта людей экстракцией гомогената печени, выделение антидельта из сыворотки крови больных гепатитом дельта хроматографией на сефадексе ДЕАЕ А-50, сенсибилизацию пробирок раствором антидельта, радиойодирование антидельта по классической методике с применение хлорамина Т, постановку радиоиммунологического анализа по следующей схеме; внесение в пробирки дельта-антигена;инкубация; промывка; внесение в пробирки исследуемых образцов; инкубация; промывка; внесение в пробирки 125 акпидельта; инкубация; промывка; измерение связавшейся с пробирками радиоактивности; оценка результатов анализа.

- Известный способ обладает достаточной специфичностью и не требует высокой степени очистки дельта-антигена, однако он характеризуется трудоемкостью постановки анализа (3 операции внесения реактивов, 3 инкубации, 3 отмывки) и относительно большим расходом дефицитного (ввиду труднодоступности источника выделения) препарата дельта-антигена. Кроме того, изготовленная на основе известного способа тест-система уступает по чувствительности лучшим мировым образцам.

Целью изобретения является упрощение методики постановки радиоиммунологического анализа, экономия труднодоступного препарата дельта-антигена и увеличение чувствительности способа.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу включающему выделение дельта-антигена из постмортальной ткани печени, выделение антител к антигену вируса гепатита дельта (антидельта) из сыворотки крови больных хроническим гепатитом дельта, изготовление твердой фазы - сенсибилизированных антидельта пробирок, радиойодирование антидельта с применением хлорамина Т и постановку радиоиммунологического анализа, радиойодирование антидельта проводят путем последовательного смешивания раствора Na125J. хлорамина Т из расчета (0,1-0,5) г хлорамина Т на 1 мКи Na125J и раствора антидельта, а при постановке радиоиммунологического анализа исследуемые образцы вносят одновременно с препаратом дельта-антигена.

Предлагаемый способ отличается от известных последовательностью внесения реагентов в реакционную смесь при проведении радиойодирования, экспериментально подобранным для данной последовательности операций соотношением количества хлорамина Т и радиоактивного

материгта(0,1 10s-0,5 10 8 г хлорамина Т на 1 мКи Na125J) и методикой постановки радиоиммуноанализа - одновременным внесением в реакционные пробирки анализируемых образцов и дельта-антигена и совместной их инкубацией с твердой фазой.

Предложенная последовательность внесения реакторов в реакционную смесь (Na J + хлорамин Т + белок), существенно

отличающаяся от традиционной схемы радиойодирования с применением хлорамина Т (белок Na J t- хлорамин Т) при экспериментально подобранном соотношении количества хлорамина Т и радиоактивного

материала(0,1 0,5 г хлорамина Т на 1 мКи Na 125J), приводит к увеличению чувствительности способа в 1,5-5 раз (табл 1). При использовании хлорамина Т в количестве менее 0,1 г или более 0,5 108

г на 1 мКи Na J выигрыш в чувствительности от реализации данной схемы радиойодирования теряется (табл, 2).

Кроме того, достигнутый выигрыш в чувствительности не теряется при постановке

радиоиммуноанализа по предложенной схеме, включающей одновременное внесение в пробирки исследуемых образцов и раствора дельта-антигена и их совместную инкубацию с твердой фазой Таким образом, методика постановки радиоиммуноанализа существенно упрощается новая схема предполагает две операции внесения реактивов в пробирки, две инкубации, две отмывки взамен трех операций внесения,

трех инкубации и трех отмывок по прототипу.

Предложенная схема постановки радиоиммуноанализа обеспечивает также уменьшение расхода труднодоступного

препарата дельта-антигена. Оптимальная чувствительность предложенного способа достигается при использовании для постановки радиоиммуноанализа разведенного в 100 раз препарата дельта-антигена (табл 3)

При этом по предложенной схеме на одно определение расходуется 50 мкл разведенного препарата. По прототипу тот же самый препарат дельта-антигена разводится для постановки анализа в 50 раз, причем расход

разведенного препарата на одно определение составляет 100 мкл. Следовательно, при реализации предлагаемого способа достигается четырехкратная экономия дельта-антигена на одно определение по сравнению

с прототипом.

Таким образом, проведение радиойодирования анти-дельта путем последовательного смешивания раствора Na125J, раствора хлорамина Т из расчета (0,1-0,5) 108гхлорамина Т на 1 мКи Na125J и раствора антидельта, а также внесение в пробирку при постановке радиоиммуноанализа раствора дельта-антигена одновременно с исследуемыми образцами обеспечивают увеличение чувствительности способа в 1,5-5 раз, упрощение методики поставки радиоиммуноанализа и четырехкратную экономию труднодоступного препарата дельта-антигена.

Способ реализуют следующим образом.

П р и м е р 1. Выделение дельта-антигена.

4г печени погибшего больного хроническим гепатитом дельта заливали 20 мл буферного раствора (состав, М: гуанидинх- лорид 6; NaCI 0,15; ЭДТА 0,025; трис-НС 0,05; рН 7,5), гомогенизировали 10 мин в гомогенизаторе Поттера и центрифугировали гомогенат в течение 30 мин при ЮОООд. Надосадочную жидкость сливали и использовали как препарат дельта-антигена.

Выделение антидельта,

5мл сыворотки крови больного хроническим гепатитом дельта (РИА титр антидельта 1:200000) диализовали в течение 24 ч против 0,01 М фосфатного буфера рН 8,0. Раствор осветляли центрифугированием (ЮОООд, 5 мин) и наносили на колонку с сефадексом ДЕАЕ А-50 объемом 20 мл, уравновешенную 0,01 М фосфатным буфером рН 8,0. Элюцию проводили тем же буфером. Оптическую плотность элюата регистрировали проточным денситометром Uvicord SII на длине волны 280 нм. Фракции, соответствующие пику оптической плотности, объединяли и диализовали против физиологического раствора, забуферен- ного 0,01 М трис-HCI рН 7,5. Концентрация белка в растворе, определенная спектрофо- тометрически с использованием соотношения С(мг/мл)ОД 280/1,35, составила 0,75 мг/мл.

Изготовление твердой фазы - пробирок, покрытых антидельта.

Выделенный препарат антидельта разводили 0,2 М карбонатным буфером рН 9,5 до конечной концентрации 5 мкг/мл и вносили порциями по 150 мкл в полиэтиленовые пробирки вместимостью 1,5 мл. Пробирки выдерживали в течение ночи при комнатной температуры, удаляли раствор, трижды промывали пробирки дистиллированной водой и высушивали при комнатной температуре.

Радиойодирование антидельта (изготовление 125и-антидельта)

В коническую пластмассовую пробирку вместимостью 1,5 мл помещали 1,5 мКи

Na125J в объеме 5 мкл. добавляли 5 мкл раствора хлорамина Т с концентрацией 0,5 мкг /мл, перемешивали, выдерживали 30 с и вносили в смесь 60 мкл раствора антидельта с концентрацией 0,75 мг/мл. Реакционную смесь тщательно перемешивали, выдерживали 5 мин и наносили на колонку с сефадексом G-25 Medium объемом 15 мл, уравновешенную 0,05 М трис-HCI рН 7,5.

Элюцию проводили тем же буфером. Собирали фракции объемом по 0,5 мл. Фракции, соответствующие первому пику радиоактивности 125J по прибору ДРГДА-1, объединяли и разбавляли буфером (состав: 0,01 М

трис-HCI рН 7,5; 0,14 М NaCI; 3% бычьего сывороточного альбумина: 5% сыворотки человека, не содержащей маркеров вируса гепатита дельта; 0,1 % твин-20; 0,001 % NaNa до объемной активности 75кБк/мл.

Постановка радиоиммунологического анализа.

В 4 сенсибилизированные- антидельта пробирки вносят по 50 мкл отрицательного контроля (сыворотка крови человека, заведомо не содержащая маркеров вируса гепатита дельта), в 2 пробирки - по 50 мкл положительного контроля (сыворотка крови больного хроническим гепатитом дельта), в остальные пробирки - по 50 мкл неизвестных сывороток для анализа. Затем во все пробирки добавляют по 50 мкл разведенного в 100 раз буферным раствором (состав: 0,14 М NaCI, 0,01M трис-HCI рН 7,5; 0,1% твин-20, 0,5% бычьего сывороточного альбумина) препарата дельта-антигена и перемешивают легким встряхиванием пробирок.

Выдерживают пробирки в течение ночи при комнатной температуре.

Удаляют содержимое пробирок и трижды промывают их дистиллированной водой. Вносят во все пробирки по 100 мкл препарата J-антидельта с объемной активностью 75 кБк/мл

Выдерживают пробирки в течение 4 ч

при комнатной температуре.

Удаляют содержимое пробирок и пятикратно промывают их дистиллированной водой.

Связавшуюся с пробирками радиоактивность J измеряли при помощи однока- нального ядерного спектрометра NP-420L Результаты анализа расценивали как значимые, если отношение среднего счета (за вычетом фона счетчика) положительных и отрицательных контролей было не менее 5. Положительными в данном тесте (т е. содер- жащими антидельта) считали сыворотки, счет связавшейся.радиоактивности которых превышал полусумму средних значений счета положительных и отрицательных контролем.

Относительная чувствительность реализованного таким образом способа составила 1:2000.

Под чувствительностью метода принято понимать минимальное достоверно выявляемое данным методом количество вещества. Однако отсутствие общепринятого международного стандарта антидельта делает прямое количественное определение чувствительности невозможным. Поэтому для сравнения различных тест-систем и способом определения антидельта по чувствительности (способ тест-система + методика постановки анализа), относительная чувствительность определялась как максимальное достоверно положительное в анализе разведение одной и той же сыворотки больного хроническим гепатитом дельта. Таким образом, полученные значения разведений применимы только для сравнения по чувствительности описанных тест-систем и способов между собой.

П р и м е р 2. Осуществляли способ по прототипу, за исключением этапа радиойодирования антидельта. Радиойодирование антидельта проводили, как описано в примере 1. Определяли относительную чувствительность изготовленных таким способом тест-систем и тест-систем, изготовленных по прототипу (постановка радиоиммуноана- лиза при определении относительной чувствительности в обоих случая проводилась по прототипу).

Полученные результаты приведены в табл. 1.

Примерз. Осуществляли способ по прототипу, за исключением этапа радиойодирования антидельта. Радиойодирование антидельта проводили, как описано в примере 1. при этом концентрацию добавляемого раствора хлорамина Т варьировали от 50 до 0,05 мкг/мл. Таким образом, количество вносимого в реакцию хлорамина Т на 1 мКи Na125J варьировалось от 0,25 до 0,25 г. Определяли относительную чувствительность изготовленных тест-систем. Постанову радиоиммуноанализа при

определении относительной чувствительности проводили по прототипу.

Полученные результаты приведены в табл. 2.

Пример 4. Определяли относительную

чувствительность способа, реализуемого по примеру 1, при различных разведениях вносимого в пробирку на первой стадии постановки радиоиммуноанализа препарата

дельта-антигена.

Результаты приведены в табл. 3. Таким образом, проведение радиойодирования антидельта путем последовательного смешивания растворов Na125J,

раствора хлорамина в определенном количестве и раствора антидельта, а также одновременное внесение препарата дельта-антигена с исследуемыми образцами при постановке радиоиммунологического

анализа обеспечивают увеличение чувствительности способа в 1,5-5 раз, при этом упрощается методика за счет сокращения количества операций, а также четырехкратной экономии труднодоступного препарата

дельта-антигена.

Формула изобретения Способ определения антител к антигену вируса гепатита дельта, включающий выделение дельта-антигена из постмортальной

ткани печени, выделение антител к антигену вируса гепатита дельта (антидельта) из сыворотки крови больных хроническим гепатитом дельта, изготовление твердой фазы - сенсибилизированных антидельта пробирок, радиойодирование антидельта с применением хлорамин Т и постановку радиоиммунологического анализа, отличающийся тем, что, с целью увеличения чувствительности способа, упрощения методики постановки радиоиммунологического анализа и экономии препарата дельта-антигена, радиойодирование антидельта проводят путем последовательного смешивания растворов Na125J, хлорамина Т

из расчета (0,1-0,5) г хлорамина Т на 1 мКи Na J и раствора антидельта, а при постановке радиоиммунологического анализа исследуемые образцы вносят одновременно с препаратом дельта-антигена.

Таблица 1

Использование: вирусология, иммунология, иммунохимия; Сущность изобретения: радиойодирование антител к антигену вируса гепатита дельта (антидельта) проводят путем последовательного смешивания растворов Na J, хлорамина Т из расчета

Относительная чувствительность тест-систем при различных методах получения J-антидельта

Относительна чувствительность тест-систем при проведении радиойодирования по предлагаемому способу с вариацией количества вносимого в реакцию хлорамина Т на мКи Na125J

Относительная чувствительность предлагаемого способа определения

антидельта в зависимости от разведения препарата дельта-антигена,

вносимого в пробирку на первой стадии постановки радиоиммуноанализа

Таблица 2

Таблица 3