Способ определения гормона роста в плазме крови Советский патент 1982 года по МПК G01N33/74 

Изобретение относится к биологической промышленности и биологической химии, в частности к индикаторно-иммунологическим способам определения белковых гормонов в крови, экстрактах гипофиза или в другомбиологическом материале, получаемом при выделении гормонов. Наиболее близким к предлагаемому способу определения гормонов роста является способ, основанный на приме нении высокоактивного фермента (пероксидаза из хрена в качестве индикатора. В указанном спосбе, предусма ривается проведение работы в две ста дии: инкубирование исследуемой плазм с антителами и гормоном-индикатором в течение 8 ч и выделение комплекса гормона с антителом на иммуносорбенте, в который включены антитела против глобулинов кролика. Антисыворотку получают подкожной инъекцией В мг гормона один раз в неделю в течение месяца. В качестве сорбента используют агар, сефарозу или сефадекс. Общее время, необходимое для проведения анализа, составляет 49 ч. Схема проведения анализа следующая: к 0,1 мл исследуемой сыворотки крови прибавляют 0,5 мл антисыворотки к гормону; пробы перемешивают и инкубируют ч. Затем добавляют 0,1 мл меченого ферментом гормона,-перемешивают и вновь инкубируют 2k ч при C, после чего прибавляют 150 мкг нерастворимых антител в виде агарового иммуносорбента и инкубируют 90 мин при постоянном помешивании. Общий объем инкубационной среды составляет 1000 мкг. Иммуносорбент промывает k раза 0, раствором хлористого натрия и в иммуносорбенте определяют активность фермента. Концентрацию определяемого гормона находят по калибровочной кривой. Чувствительность этого способа не выше, чем при использовании им3ЗОУ З

портных радиоиммунологических наборов - 0,5 нг в пробе, или 5 нг/мл fl,

Недостатком его является то, что анализ длится очень долго, результат можно получить только через двое сут. 5

Цель изобретения - ус1{орение способа определения гормона роста в плазме крови.

Поставленная цель достигается тем, что в способе определения гормона to роста в плазме крови, включающем ее смешивание с антителами к гормону, инкубацию полученной смеси, добавление меченого ферментом гормона, инкубацию, прибавление иммуносорбента is ивыдерживание, промывание иммуносорбента 0,85%-ным раствором NaCl и последующее установление активности фермента на иммуносорбенте, для смешивания берут 20 мкл плазмы кро- 20 ви и 10-12 нг антител в объеме 90100 мкл,добавление меченого ферментом гормона проводят путем прибавления нг гормона-индикатора в объеме 20 мкл, а инкубацию проводят 25 2,5-3 ч.

Пример. Анализ гормона роста проводят следующим образом: к 20 мкл исследуемой биологической jp жидкости (например, плазмы крови) прибавляют 10-12 нг кроличьих антител в объеме 98-100 мкл; антитела должны быть иммобилизованы на сорбенте (например, по способу Кузовлевой: Кузовлева 0. Б.,

Выделение индивидуальных белков проводят при помощи новых иммуносорбентов, способных присоединить большие количества антигена. Затем IB каждую из пробирок по 9-10 нг гормона-индикатора в объеме 20 мкл. Пробирки инкубируют 2,5-3,0 ч при 37С, после чего иммуносорбент промывают, удаляя таким образом не свя- завшийся гормон-индикатор. В иммуносорбенте определяют пероксидазную активность, которую выражают в процентах к активности фермента в пробе, в которую не вносили ни стандарт- 50 ный, ни определяемый гормон. Концентрацию определяемого гормона находят по калибровочной кривой, построенной с несколькими разведениями стандартного гормона (от О,1 до 55 2,О нг/мл) .

Пример2. 3 работе использовали очищенный препарат гормона рос4

та. Однако очистка в соответствии с требованиями для радиоиммунного стан дарта в данном способе не требуется. Антисыворотку получали путем однократной внутрикожной инъекции гормонального препарата животному (например, кролику), либо методом многократных подкожных инъекций микродоз (0,-0,5 мг) очищенного гормона. I . .

Предлагаемый способ может быть выполнен следующим образом: к 20 мкл исследуемой биологической жидкости, например плазмы крови, прибавляли 12 нг кроличьх антител в виде иммуносорбента в объеме 10 мкл. Затем в каждую из пробирок вносили по 10 нг гормона-индикатора в объеме 20 мкл. Пробирки инкубировали 3 ч при 37°С, затем иммуносорбент промывали три раза 0, раствором хлористого натрия при рН 7,0-7,2. Непосредственно в иммуносорбенте определяли пероксидазную активность путем прибавления к суспензии иммуносорбента 1,5 мл реактива, забуференного фосфатами до рН6,0 и содержащего 2,5x10 перекиси водорода и 7 10о орт.одианизидина. Пероксидазную активность выражали в процентах к активности фермента в нулевой пробе, не содержащей ни стандартный, ни определяемый гормон. Концентрацию определяемого гормона находили по калибровочной кривой. Калибровочную кривую строили с разведениями стандартного гормона в интервале от 0,1 до 2,0 нг/мл. Для приготовления стандартных разведений гормона роста, для разбавления меченого гормона использовали забуференный фосфатами до рН 7, 0,15 молярный раствор хлористого натрия, содержащий компонент, препятствующий адсорбции гормона на иммуносорбенте и стенках пробирки (1 альбумина из сыворотки человека или 0,05 тритона Х-100). В качестве индикатора применяли пероксидазу из хрена, которую ковалентно конъюгировали с гормоном роста, используя для этой цели либо бифункциональные особенности глютарового альдегида либо окисляя углеводные остатки пероксидазы периодатом натрия до образования активных альдегидных групп.

При определении концентрации гормона в плазме крови этим способом и способом, взятым в качестве извест5907 376

ного, получены близкие значения аб- Сравнение предлагаемого способа солютных величин: 22,311,3 и 2211 нг/мл определения гормона роста с известсоответственно.ным

Затраты времени на определение гормона в серии образцов ((0-50 про в предлагаемом способе составляют приблизительно 5 ч, в том числе на инкубацию 3 ч, в известном - 50-52 ч из них на проведение инкубации- Указанный способ определения гор мона роста апробирован в практике р боты Всесоюзного научно-исследовательского института физиологии, биохимии и питания сельскохозяйственных животных для определения гор мона роста в крови молодняка крупного рогатого скота (как у нормальных животных, так и в различных физиологических опытах) и при очистке гормональных препаратов. Чувствительность способа, определенная по калибровочной кривой со стандартным препаратом гормона роста, составляет О , 1 нг/мл, точность (по ряду парадлельных образцов) - 88. По этим критериям предлагаемый способ предпочтительнее радиоиммунологического метода и способа, взятого в качестве известного. Способ может быть использован в биологической промышленности при производстве гормональных препаратов, так как во всех процессах,связанных с выделением и очисткой гормонов, предусмотрен многократный контроль активности промежуточных продуктов и основного препарата. формула изобретения Способ определения гормона роста в плазме крови, включающий ее смешивание с антителами к гормону, инкубацию полученной смеси, добавление меченного ферментом гормона, инкубацию, прибавление иммуносорбента и выдерживание промывания иммуносорбента 0,85%-ным раствором NaCl и последующее установление активности фермента на иммуносорбенте, отличающийся тем, что, с целью

7 907А378

ускорения способа определения, дляИсточники информации,

смешивания берут 20 мкл плазмы кро-принятые во внимание при экспертизе ви и 10-12 нг антител в объеме 90100 мкл, добавление меченого фермен-1, Ефсик В. Ф, Ферментно-иммуноToh гормона проводят путем прибавле-s логический метод определения белкония 9-10 нг гормона-индикатора в вых гормонов в крови и биологических

объеме 20 мкл, а инкубацию проводятжидкостях.- Проблемы эндокринологи ;.

2,5-3,0 ч.1977, т. 23, №6, с. 82-85.