СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К MYCOBACTERIUM LEPRAE НА ТВЕРДОМ НОСИТЕЛЕ Российский патент 2012 года по МПК G01N33/53 C12Q1/04 

Изобретение относится к области медицины, а именно к иммунологии, в частности, может быть использовано для выявления антител или антигенов в иммуноферментном анализе (ИФА) в биологических субстратах организма.

Из практики медицины известен способ выявления антитела или антигена в радиоиммунном анализе, состоящий в том, что при их выявлении используют поверхности полистироловых пробирок, шариков в качестве носителей иммунологически активных компонентов реакции, в том числе и радиоактивной метки (Манолов А.Д. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии, №4, 1985, с.100-107; Чард Т. Радиоиммунологические методы. - М.: 1981).

Однако известный способ имеет следующие недостатки: сложность осуществления, так как требует наличия дорогостоящего оборудования, специальной утилизации отходов реакции, защиты персонала и окружающей среды. Кроме этого, радиоактивная метка нестабильна, что обуславливает короткий срок хранения конъюгата. Известный способ не дает возможность получить конкретный технический результат - упрощение способа.

Из практики медицины известен также способ выявления антитела или антигена на твердом носителе в реакции латекс-агглютинации, состоящий в том, что при их выявлении используют поверхность латексных частиц в качестве носителя компонентов реакции (Фримель Г. Иммунологические методы. - М.: Медицина, 1987. - 472 С.). Однако известный способ имеет следующие недостатки: сложность визуальной оценки результатов реакции при низком содержании антитела или антигена в исследуемом материале. Только у 30% больных положительных на наличие HB_s-антигена в сыворотке крови больных выявляются гистологические изменения, ревматоидный фактор и продукты фибринолиза могут обуславливать возникновение ложноположительных результатов. Осуществление известного способа требует предварительной модификации химическими веществами поверхности латексных частиц (введение функционально активных групп), что не дает возможность получить конкретный технический результат - упрощение способа.

Наиболее близким способом к предлагаемому является способ выявления антитела или антигена в ИФА с использованием различных полимерных материалов таких как полистирол, поливинилхлорид, полипропилен, полиакриламид в качестве твердых носителей иммуноактивных компонентов. Наибольшее распространение получила твердая фаза из полистирола в виде 96-луночных планшетов для иммунологических реакций. Кроме этого, промышленность выпускает такие формы как пробирки, шарики, гранулы в качестве твердых носителей гомологичных антител или антигенов (Воробьев А.А., Виха И.В. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии, №9, 1987, с.3-8).

Однако известный способ имеет следующие недостатки:

- сложность осуществления способа;

- десорбция иммуноактивных лигандов с поверхности лунок полистироловых планшетов в ходе проведения ИФА;

- негомогенность материала полистироловых планшетов;

- неспособность к каплеобразованию полистироловой поверхности при нанесении на нее антигенов или антител в буферных растворах (растекание капли по поверхности).

Указанные недостатки не дают возможность получить технический результат - упрощение способа.

Одним из негативных процессов, имеющим место в твердофазном ИФА, является десорбция сорбированных на пластике лигандов. В процессе реакции, проходящей в три этапа: последовательная инкубация на фиксированном антигене сывороток, конъюгата и субстрата, между которыми следует тщательное отмывание реагентов, происходит постепенная утечка антигена. По данным O.P. Lehtonen et al. (Lehtonen O.P., Viljanen M.K. // J. immunol. Meth. - 1980. - Vol.34. - P.61-70), такая потеря антигена с полистирола достигает 30%. Гидрофобное взаимодействие при адсорбции иммунохимического лиганда на поверхности пластика играет основную, если не главную роль при осуществлении этого процесса. Кроме этого, полимерные носители имеют низкую емкость, вследствие чего, для определения содержания антигена необходимо брать большое количество антительного иммуносорбента или иммобилизовывать на нем высокоаффинную фракцию антител. На емкость носителя оказывает влияние и неконтролируемый фактор - негомогенность материала полимерных носителей (Гаврилова Е.М. Журнал Всесоюзного химического общества им. Д.И.Менделеева, том XXVII, 4, 1982. - с.90-97).

На процесс адсорбции влияет наличие определенных функциональных групп, способных образовывать устойчивые химические связи различных типов, конформационная подвижность, участие молекул воды и т.д. Существенную роль в этом процессе играют нековалентные связи: координационные, водородные, ионные, Ван-дер-Ваальса.

Сходство предлагаемого способа с известным состоит в том, что они оба относятся к иммунологии и основаны на использовании иммобилизованных сенситинов на носителе.

Предлагаемое изобретение решает основную задачу - упрощение способа.

Фторопласт - высокомолекулярный полимер - обладает устойчивостью к действию неорганических и органических кислот, щелочей, органических растворителей, окислителей, газов и других агрессивных сред, сниженной поверхностной энергией (Кулезнев В.Н., Шершнев В.А. Химия и физика полимеров. - М.: Высшая школа, 1988). Сущность изобретения выражена совокупностью существенных признаков, достаточных для обеспечиваемого изобретением технического результата.

Решение поставленной задачи заключается в том, что на предварительно обработанной гексаном в течение 10 минут при комнатной температуре фторопластовой ленте с обратной стороны отмечают места нанесения компонентов иммунологической реакции с помощью водостойкого маркера для последующей сенсибилизации при 6°С в течение 18 часов, промывают после каждого этапа трехкратно в течение 3 минут забуференным физиологическим раствором 0,1 М рН-7,0 с добавлением 0,05% Твина-20 и пятикратно этим же буфером после иммунопероксидазного конъюгата с последовательной обработкой сывороткой крови больных, иммунопероксидазным конъюгатом и по изменению окраски субстратной смеси выявляют антитела к M.leprae или HB_s-антиген на твердом носителе.

Предлагаемым способом достигается его упрощение, так как фторопласт обладает исключительной гидрофобностью, что является определяющим фактором для фиксации сенситинов и сохранения формы капель нанесенных на его поверхность компонентов иммуноферментного анализа, возможность его проведения без использования специального сложного оборудования.

Предлагаемый способ осуществляется следующим образом. Используют фторопластовую ленту марки «ПН» толщина 0,2 мм, ширина 80 мм (производства ЗАО «Фторопластовые технологии», г.Санкт-Петербург), разрезают на полосы размером 80×10 мм, предварительно их обработывают гексаном (погружение) в течение 10 минут при комнатной температуре и с обратной стороны отмечают места нанесения компонентов иммунологической реакции с помощью водостойкого маркера для последующей сенсибилизации при 6°С в течение 18 часов, промывают ее забуференным физиологическим раствором 0,1 М pH - 7,0 с добавлением 0,05% Твина-20 (ЗФРТ) трехкратно по 3 минуты, а после иммунопероксидазного конъюгата - пятикратно, инкубируют последовательно сыворотки крови больных с постановкой отрицательного и положительного контролей, иммунопероксидазный конъюгат и по изменению окраски субстратной смеси выявляют антитела к M.leprae или HB_s-антиген на твердом носителе. Сенсибилизируют полосы фторопласта антигеном, полученным ультразвуковой дезинтеграцией M.leprae (патент №2082979 от 27.06.1997 г. «Способ определения группы риска рецидива лепры», Дячина М.Н., Дегтярев О.В.) или поликлональными козьими антителами к HB_s-антигену производства предприятия «ИмБиО», г.Н-Новгород. Оптимально исследовать на полосе фторопласта размером 80 мм × 10 мм восемь образцов, включая контроли. Все компоненты ИФА берут с помощью пипеточного дозатора в объеме 20 мкл, кроме стоп-реагента - 10 мкл.

Предлагаемый способ прошел успешную апробацию на базе ФГУ «НИИ по изучению лепры Минздравсоцразвития России», г.Астрахань на 28 больных лепроматозной формой лепры и 14 донорах крови, а также на базе ОГУЗ «Областная инфекционная клиническая больница», г.Астрахань на 24 больных острым вирусным гепатитом В и 18 донорах крови в течение 2009-2010 гг.

Пример №1. С целью выявления антител класса IgG у 28 больных лепроматозной формой лепры места нанесения компонентов иммунологической реакции на фторопластовой ленте, помещенной в чашку Петри, сенсибилизируют антигеном из ультразвукового дезинтеграта М. leprae 5 мкг/мл в объеме 20 мкл в карбонат-бикарбонатном буфере рН-9,6 для каждого образца сыворотки крови при 6°C в течение 18 часов. Несвязавшийся антиген с сенсибилизированной ленты удаляется стряхиванием и промыванием в ванночке трижды по 3 минуты в 10 мл забуференного физиологического раствора 0,1М рН-7,0 с 0,05% твина-20 (ЗФРТ). После этого наносят разведенные 1:400 в ЗФРТ сыворотки крови больных и донора (отрицательный контроль) и инкубируют в термостате при 37°C в течение 1 часа. Вновь проводят промывку как указано выше. Затем наносят на места предыдущего расположения компонентов реакции иммунопероксидазный конъюгат - анти-IgG человека 1:5000 в ЗФРТ в том же объеме - 20 мкл. Время и условия инкубации те же, что и сывороток. Несвязавшиеся молекулы конъюгата удаляют тщательной 5-кратной по 3 минуты промывкой в ЗФРТ.

Результаты реакции оценивают визуально по разнице окрашивания субстратной смеси 0,04% раствора ортофенилендиамина в цитратно-фосфатном буфере рН-5,0 и 0,03% перекиси водорода после 10-минутной экспозиции при комнатной температуре в темном месте и останавки ее внесением в каждый образец 10 мкл 2М H₂SO₄. Отрицательный контроль остается бесцветным, а в местах нанесения сывороток крови больных цвет субстратной смеси варьирует от светло-желтого до коричневого в зависимости от количественного содержания специфических иммуноглобулинов класса G к M.leprae.

Пример №2. С целью выявления поверхностного антигена вируса гепатита В (HBs-антиген) у 24 больных острым вирусным гепатитам В (ОГВ), находившихся на лечении в ОГУЗ «Областная инфекционная клиническая больница», г.Астрахань и 18 доноров (отрицательный контроль), места нанесения компонентов иммунологической реакции фторопластовой ленты сенсибилизируют 2 мкг/мл поликлональных козьих антител к HBs-антигену в карбонат-бикарбонатном буфере рН-9,6 в объеме 20 мкл, производства предприятия «ИмБиО», г.Н-Новгород с содержанием белка 1 мг/мл, титр 1:128 в двойной иммунодиффузии по Оухтерлони. Положительным и отрицательным контролями, иммунопероксидазным конъюгатом к HBs-антигену, субстратной смесью и стоп-реагентом служат компоненты коммерческого набора «Вектогеп B-HBs-антиген-стрип» (комплект 3), производства ЗАО «Век-тор-Бест», г.Новосибирск. Диагноз острого гепатита B подтвержден клинико-лабораторными данными и в ИФА наличием в сыворотках крови больных HBs-антигена по общепринятой методике.

Постановка способа аналогична примеру №1, кроме разведения образцов сывороток и конъюгата, которые готовят согласно прилагаемой к набору инструкции.

Хранение сенсибилизированных лент в течение шести месяцев при 6°C в чашках Петри не снижает их эффективности (срок наблюдения).

Таким образом, авторами представлен способ, в котором используют фторопластовую ленту, никем ранее не предложенную в качестве твердого носителя сенситинов для выявления гомологичных антител и антигена в ИФА.

Предлагаемым способом достигается положительный результат, который заключается в упрощении способа выявления антитела или антигена на твердом носителе, способность биокомпонентов, буферных растворов солей и воды сохранять форму капли при нанесении их на поверхность фторопластовой ленты. Обеспечивается эффективная фиксация сенситинов за счет исключительной гидрофобности полимера, экономичность расходования компонентов ИФА (20 мкл расходного материала на каждый этап реакции по сравнению с прототипом - 50-100 мкл), возможность проведения ИФА без использования сложной лабораторной техники. Наличие компьютерной видеоцифровой технологии позволит регистрировать количественное содержание искомых антител или антигена в биологических субстратах организма.

Предложенный способ может быть рекомендован для использования иммунологическими лабораториями учреждений системы здравоохранения, так как прост в исполнении, не требует дорогостоящего и сложного оборудования персонала.

Изобретение относится к области медицины. Предложен способ выявления антител к Mycobacterium leprae (M.leprae) на твердом носителе. Места нанесения компонентов иммунологической реакции в ИФА на твердом носителе (фторопластовой ленте) сенсибилизируют антигеном из ультразвукового дезинтеграта (соникатом) M.leprae дозой 5 мкг/мл в объеме 20 мкл для каждого образца сыворотки крови больных. Затем наносят на места предыдущего расположения компонентов реакции иммунопероксидазный конъюгат против IgG человека в том же объеме. Несвязавшийся антиген с сенсибилизированной ленты удаляется буферным раствором (ЗФРТ) после каждого этапа реакции. Результаты реакции оценивают визуально по разнице окрашивания субстратной смеси. Изобретение обеспечивает упрощение способа выявления антител к M.leprae за счет использования в ИФА твердого носителя - фторопластовой ленты. 2 пр.

Способ выявления антител к Mycobacterium leprae (М.leprae) на твердом носителе, состоящий в определении антител к M.leprae в сыворотках крови больных в ИФА на сенсибилизированном соникатом M.leprae дозой 5 мкг/мл твердом носителе с последующей обработкой его сывороткой больных, иммунопероксидазным конъюгатом против IgG человека, промывкой буферным раствором (ЗФРТ) после каждого этапа реакции, и по изменению окраски субстратной смеси судят о наличии или отсутствии антител к M.leprae, отличающийся тем, что компоненты ИФА в объеме 20 мкл наносят на предварительно обработанную гексаном в течение 10 мин при комнатной температуре фторопластовую ленту.