Изобретение относится к биотехнологии, генной инженерии и иммунологии и представляет собой набор рекомбинантных белков, синтезированных в бактериальных клетках и позволяющих проводить серодиагностику гепатита С.
Гепатит С возникает в результате заражения вирусом гепатита С и отличается от других форм вирусассоциированных заболеваний печени, включая уже известные гепатит А, гепатит В, гепатит D, а также гепатитов, вызванных вирусом Эпштейн-Барра или цитомегаловирусом. Заражение вирусом гапатита C, как правило, осуществляется при переливании крови. Вирус гепатита C при попадании в организм поражает клетки печени. Клинически гепатит C протекает более легко, чем гепатит В. Однако показано, что почти у пятидесяти процентов пациентов болезнь принимает хроническое течение с периодическим обострением процесса и у двадцати процентов хронических больных гепатитом С заболевание приводит к циррозу печени. Кроме того, имеются данные о том, что заражение вирусом гепатита С имеет прямое отношение к возникновению первичного рака печени.
Поэтому, для проведения противоэпидемических и профилактических мероприятий крайне актуальна разработка диагностических препаратов, позволяющих выявлять людей, инфицированных вирусом гепатита С.
Многочисленные исследования вируса гепатита С позволили определить его структуру, организацию генома, выяснить механизм экспрессии и функции отдельных вирусных белков. Вирус гепатита С имеет позитивный РНК-геном, состоящий примерно из 9400 нуклеотидов. Геном содержит единственную открытую рамку считывания, перекрывающую его часть, и может кодировать большой вирусспецифический полипептид, состоящий из 3010-3011 аминокислотных остатков, являющийся предшественником индивидуальных структурных и неструктурных вирусных белков. К структурным белкам вируса гапатита С относятся Cor (ядерный)-антиген (молекулярная масса 19 кДа) и два гликопротеина с молекулярными массами 32 кДа и 72 кДа. Все они процессируются с N-концевого участка вирусспецифического полипротеина. Cor-антиген обладает способностью связывать РНК и образует нуклеокапсид вируса гепатита С. Белок размером 32 кДа предположительно является матриксным или поверхностным белком вириона вируса гепатита С, а белок размером 72 кДа является либо поверхностным белком вириона, либо первым неструктурным белком вируса гепатита С (NSl). Белок NS2 вируса гепатита С размером 23 кДа ассоциирован с мембранами зараженных вирусом клеток, однако его функциональная роль неизвестна. Белок NS3 (размером 60 кДа) обладает нуклеотид трифосфат связывающей геликазной активностью и ферментативной активностью сериновой протеазы. По-видимому, он участвует как в репликации вирусного генома, так и в процессинге неструктурных белков вируса гепатита С. Продукты экспрессии генов NS4 и NS5 еще не охарактеризованы, однако они могут кодировать белки размером 52 и 116 кДа соответственно. Как и белок NS2, белок NS4 гидрофобен и, вероятно, является мембраносвязывающим белком с неизвестной функцией. Продукт экспрессии гена NS5 многофункционален, обладает РНК-зависимой РНК-полимеразной активностью, участвуя таким образом в репликации вирусного генома.
Большинство методов диагностики инфицированности вирусом гепатита С основано на определении антител к белкам вируса гепатита С в сыворотках крови (серодиагностика). Для этих целей используются различные подходы, в которых применяются принципы иммуноферментного анализа (ИФА), реакции агглютинации (латекса, эритроцитов), иммунофлуоресценции, иммуноблотинга и радиоиммунопреципитации. Одними из наиболее перспективных путей совершенствования всех этих диагностических тест-систем является использование в качестве антитело-связывающего субстрата рекомбинантных белков вируса гепатита С, синтезированных в различных экспрессирующих системах. Использование таких рекомбинантных белков, сохраняющих антигенные детерминанты вируса гепатита С, вместо вирусных антигенов не только увеличивает специфичность и чувствительность тест-систем, но и делает их безопасными в работе.
Так, в частности, известен диагностический набор фирмы Ortho Diagnostic Systems (США), в котором используется рекомбинантный белок cl00-3. Белок c100-3 является химерным полипептидом, состоящим из 363 амино-кислотных остатков участков генов NS3 и NS4 вируса гепатита С и 154 аминокислотных остатков супероксиддисмутазы человека. Этот белок продуцирует рекомбинантные клетки дрожжей (EP 0 318 216, C12N15/51, 1989). Другой коммерческий диагностический набор фирмы Abbott (США) включает структурные (Cor-антиген), и неструктурные (NS3, NS4) белки вируса гепатита С, синтезированные в клетках Escherichia soli в виде химерных белков, где вирусспецифические последовательности аминокислот слиты с белком-носителем: цитидинмоно-фосфат-2-кето-3-дезокси-окто-нат-синтетазой. Эти наборы предназначены для обнаружения антител к вирусу гепатита C в сыворотках крови.
Процедура иммуноферментного анализа в обоих случаях состоит из трех стадий. Химерные полипептиды иммобилизуют на твердом носителе (полистироловые или полихлорвиниловые планшеты или шарики для иммунологических реакций), либо в смеси, либо по отдельности, в зависимости от решаемой задачи. На первом этапе к полученному иммуносорбенту добавляют образцы сыворотки или плазмы в определенных разведениях (для разведения сывороток используют специальный разводящий буферный раствор). Если антитела к вирусу присутствуют в анализируемых образцах, на поверхности иммуносорбента происходит образование комплекса антиген-антитело, а несвязавшиеся с иммуносорбентом белки плазмы или сыворотки удаляют при последующей отмывке. На второй стадии иммуносорбент инкубируют в присутствии конъюгата мышиных моноклональных антител (против иммуноглобулинов G человека) с пероксидазой хрена, специфически взаимодействующих с антителами человека. Если на поверхности иммуносорбента отсутствует комплекс антиген-антитело, то несвязавшийся конъюгат удаляется при последующей промывке. На третьей стадии иммуносорбент инкубируют в присутствии ортофенилендиамина и перекиси водорода. Если конъюгат присутствует на поверхности иммуносорбента, ортофенилендиамин окисляется, образуя окрашенное вещество, указывая на наличие комплекса антиген-антитело.
Реакцию останавливают серной кислотой. Интенсивность окраски зависит от количества связавшегося конъюгата, что зависит от концентрации антител, присутствовавших в исследуемом образце, и определяется с помощью спектрофотометра.
Сущность предлагаемого технического решения состоит в том, что предложена серия наборов для определения антител к вирусу гепатита С. Наборы включают ряд рекомбинантных полипептидов со свойствами антигенов вируса гепатита С, полученных с помощью методов генетической инженерии из штаммов-продуцентов, трансформированных рекомбинантными ДНК, содержащими участки генов вируса гепатита С.
Наборы включают полипептиды со следующими аминокислотными последовательностями (см. фиг. 1).
В тексте указанные аминокислотные последовательности названы HCl17, HC82, HC88 соответственно.
Полипептиды, входящие в набор, иммобилизуют на твердом носителе, либо в смеси, либо по отдельности, в зависимости от решаемой задачи.
Носителем могут служить полистироловые или полихлорвиниловые планшеты или шарики для иммунологических реакцией, нитроцеллюлоза, нейлон, латексы, эритроциты, а также другие твердофазные носители.
Данное техническое решение отличается от известных:
1) структурой полипептидов, используемых для приготовления иммуносорбента;
2) использованием в некоторых вариантах в качестве белка носителя и контрольного антигена бета-галактозидазы E. coli (фирма Abbott использует цитидинмоно-фосфат-2-кето-3-дезокси-октанат-синтетазу, а фирма Ortho - супероксиддисмутазу).
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. Получение набора для массового серологического исследования образцов сыворотки или плазмы крови на присутствие антител к рекомбинантным антигенам продуктам фрагментов генов Cor-антигена (HС117), белков NS3 (HC82) и NS (HC88) вируса гепатита C.
Для получения штамма продуцента полипептида HС117 трансформируют клетки E. coli штамм PLT90 плазмидов ДНК pHC365, содержащей фрагмент ДНК HC365 с нуклеотидной последовательностью (см. фиг. 2) и ДНК векторной плазмиды pEL5A.
Трансформированные клетки высевают на чашки с 1% LB-агаром, содержащим ампициллин в концентрации 50 мкг/мл. Выросшие колонии проверяют на наличие рекомбинантных плазмид. Для этого бактериальные клетки лизируют и выделяют плазмидную ДНК. Выделенную плазмиду ДНК обрабатывают рестриктазами Bam HI и PstI и гидролизат исследуют электрофорезом в 2% агарозе. Гидролизат плазмидной ДНК из рекомбинантного штамма HC117 имеет на электрофореграмме 2 полосы ДНК размерами 6400 и 365 нуклеотидов, что соответствует размерам вектора pEL5A и фрагмента ДНК HC365.
Штамм E. coli HC117, содержащий плазмиду pH365, выращивают в 100 мл среды LB при 30oC до плотности 8х10 кл/мл. После этого температуру повышают до 40oC и растят клетки еще в течение 2-х часов. Клетки собирают центрифугированием при 4000 об/мин в течение 15 мин. Клетки лизируют ультразвуком и выделяют белки по описанному методу (EMBO J. 1984, 3, 1429).
Выделенные белки анализируют в 10% ПААГ по стандартному методу Лэммли (Nature, 227, 680 685, 1970). В качестве маркеров молекулярных масс белков используют набор фирмы "Pharmacia", содержащий маркеры молекулярных масс от 20 до 160 кД. В качестве контроля используют полученный аналогичным образом лизат клеток штамма E. coli PLT90, содержащий векторную плазмиду рEL5A и не содержащий плазмиду pHC365.
Сравнительный анализ белкового состава показывает, что штамм E. coli HC117, содержащий плазмиду pHC365, экспрессирует гибридный полипептид с молекулярной массой 150 160 кД (или 18 19 кД без бета галактозидазы).
Контроль антигенной активности препаратов осуществляют методом иммуноблотинга. Для этого проводят процедуру электрофореза (как описано выше), затем осуществляют перенос электрофоретически разделенных белков на нитроцеллюлозные мембраны BH85 с помощью аппарата для электроблотинга в режиме 24В, 440 мА в течение 1 часа. Количество переноса проверяют окрашиванием мембран раствором 0,2% Понсо S в 3%-ной TXУ в течение 5 мин при комнатной температуре. Краску дважды отмывают в течение 30 мин TBS (0,15M NaCl, 20 mM трис-HCL, pH 7,4) с 0,05% Твина-20 при комнатной температуре. На следующем этапе проводят блокирование нитроцеллюлозных мембран с иммобилизованными белками раствором 5% -ного обезжиренного сухого молока, приготовленном на 0,1 М Na-фосфатном буфере, pH 7,4, в течение 30 минут при комнатной температуре. После блокирования мембраны в течение 1 час при 37oC обрабатывают сыворотками, содержащими антитела к вирусам гепатита C, в разведении 1:100. Затем проводят трехкратную отмывку мембран TBS с 0,05%-ным Твином-20 в течение 30 мин при комнатной температуре. Выявление специфических антител осуществляют инкубацией фильтра с антивидовым пероксидазным конъюгатом при 37oC в течение часа. Далее повторяют процедуру трехкратной отмывки. Реакцию проверяют добавлением 100 млк 30%-ной перекиси водорода и 50 мл раствора 4-хлор-1-нафтола (20 мг в 0,01 М трис-NCl, pH 8,0). Анализ показывает, что полипептид HC117 связывается с антителами к вирусу гепатита C.
Для получения штамма продуцента полипептида HC82 трансформируют клетки E. coli штамм PLT90 плазмидной ДНК pHC 250, содержащей (см. фиг. 3).
Трансформированные клетки высевают на чашки с 1% LB-агаром, содержащим ампициллин в концентрации 50 мгк/мл. Выросшие колонии проверяют на наличие рекомбинантных плазмид. Для этого бактериальные клетки лизируют и выделяют плазмидную ДНК. Выделенную плазмидную ДНК обрабатывают рестриктазами Bam HI и PstI и гидролизат исследуют электрофорезом в 2% агарозе. Гидролизат плазмидной ДНК из рекомбинантного штамма HC250 имеет на электрофореграмме 2 полосы ДНК размерами 6400 и 256 п. н. что соответствует размерам вектора и синтезированного фрагмента ДНК HC250.
Штамм E. coli HC250, содержащий плазмиду pHC250, используют для получения гибридного белка HC82 с молекулярной массой 120 130 кД, содержащего последовательность белка NS3 слитную с бета-галактозидазой E. coli (или 11 - 12 кД без бета-галактозидазы).
Анализ белкового состава штамма E. coli HC250 и контроль антигенной активности полипептида HC82 проводят, как описано выше для штамма HC117.
Для получения штамма продуцента полипептида HC88 трансформируют клетки E. coli штамм PLT90 плазмидной ДНК pHC 280, содержащей:
фрагмент ДНК HC280 с нуклеотидной последовательностью и ДНК векторной плазмиды pEL5a (см. фиг.4).
Трансформированные клетки высевают на чашки с 1% LB- агаром, содержащим ампициллин в концентрации 50 мкг/мл. Выросшие колонии проверяют на наличие рекомбинантных плазмид. Для этого бактериальные клетки лизируют и выделяют плазмидную ДНК. Выделенную плазмидную ДНК обрабатывают рестриктазами Bam HI и PstI и гидролизат исследуют электрофорезом в 2% агарозе. Гидролизат плазмидной ДНК из рекомбинантного штамма HC88 имеет на электрофореграмме 2 полосы ДНК размерами 6400 и 280-290 нуклеотидов, что соответствует размерам вектора pEL5A и фрагмента ДНК HC280.
Штамм E. coli HC88, содержащий плазмиду pHC280, используют для получения полипептида HC88 с молекулярной массой 120-130 кД, содержащего последовательность белка NS4 слитную с бета-галактозидазой E. coli. Анализ белкового состава штамма E. coli HC88, контроль антигенной активности белка HC88 проводят, как описано выше для штамма HC117.
Вышеуказанные штаммы бактерий E.coli выращивают на среде LB с селективными добавками, клетки собирают центрифугированием, разрушают ультразвуком. Тельца включения, содержащие рекомбинантные полипептиды, промывают с помощью центрифугирования, солюбилизируют. Полипептиды очищают с помощью хроматографических методов, чистоту полученных полипептидов анализируют с помощью ДДС-Na-электрофореза в 10% полиакриламидном геле.
При изготовлении иммуносорбента на полистироловые или полихлорвиниловые планшеты для иммунологических реакций сорбируют смесь полипептидов HC117 (концентрация 2,5 мкг/мл), HC82 (6 мкг/мл), HC88 (6 мкг/мл) и отдельно КАг (контрольный антиген бета-галактозидаза в концентрации 10 мкг/мл) растворенных в 0,06М карбонат-бикарбонатном буфере pH 9,6. По 100 мкл раствора смеси полипептидов и контрольного антигена вносят в лунки полистироловых или полихлорвиниловых планшет для иммунологических реакций как указано на фиг.1. Сорбцию ведут при 4-6oC в течение 16-18 часов.
Конъюгат пероксидазы хрена с белком A St.aureus или антивидовыми антителами получают с помощью периодатного окисления с последующей хроматографической очисткой готового конъюгата. Конъюгат, контрольные сыворотки и буферную смесь с гидроперитом (БСГ) для пероксидазной реакции лиофилизируют в ампулах, запаивают в атмосфере инертного газа. В качестве контрольного положительного иммунореагента используют сыворотку крови человека или животных, содержащую антитела к вирусу гепатита C (K+). В качестве контрольного отрицательного иммунореагента (K-) используют сыворотку крови человека или животных не содержащую антитела к вирусу гепатита C.
Иммуносорбент перед использованием трехкратно промывают. Для промывок используют фосфатный буферный раствор pH 7,2 с 0,5% Твином-20 (ФСБ-Т). Процедуру проводят при помощи автоматического или ручного промывателя, внося не менее 0,2 мл раствора в лунку. По окончании промывки удаляют влагу из планшета.
В 86 из 96 лунок вносят по 90 мкл раствора для разведения сывороток, содержащего 4-х% раствор клеток E.coli, лизированных ультразвуком, в ФСБ-Т. В 86 лунок добавляют попарно (например сыворотку N1 в лунки A 1и 2) по 10 мкл предварительно разведенных (1:10) в данном растворе 43 образца исследуемых сывороток, перемешивая содержимое лунок пипетированием или с помощью встряхивателя. В незаполненные 4 лунки, например, в H 9,10,11,12 вносят 100 мкл K-, в 4 лунки (например, G 9,10,11,12) по 100 мкл K+ и в 2 лунки по 100 мкл раствора для разведения сывороток (контроль конъюгата -KK).
На фиг. 5 показано расположение сорбированных рекомбинантных антигенов в смеси (ряды планшета а) КАг (ряды планшета b).
Планшет заклеивают пленкой и выдерживают в течение 60 минут при температуре 37oC.
Содержимое лунок удаляют, планшет 5-ти кратно промывают и полностью удаляют влагу. Во все лунки планшета вносят по 100 мкл конъюгата. Планшет заклеивают новым листом пленки и выдерживают в течение 60 мин при температуре 37oC.
Содержимое лунок удаляют, планшет 5-ти кратно промывают и полностью удаляют влагу. В каждую лунку планшета вносят по 100 мкл 0,05% ортофенилендиамина в растворе БСГ. Планшет помещают в защищенное от света место на 20-40 минут при температуре 15-25oC. Реакцию останавливают внесением во все лунки по 50 мкл 2N серной кислоты.
Регистрацию проводят немедленно на спектрофотометре типа "Мультискан", измеряя оптическую плотность (ОП) при длине волны 492 нм. Выведение спектрофотометра на нулевой уровень осуществляют по воздуху или по чистому сухому планшету.
Вычисляют среднее значение ОП (ОПср) для контроля конъюгата, которое должно быть не более 0,15; ОПср K- не более 0,2; ОПср K+ в пределах от 0,8 до 1,8. Для каждой сыворотки вычисляют соотношение ОПr (в лунке с сорбированными рекомбинантными антигенами) / ОПк( в лунке с KAг). Сыворотку учитывают как положительную, если соотношение равно или превышает 4. Сыворотку следует считать отрицательной, если соотношение ОПr/ОПк меньше 2,0). Сыворотку учитывают как слабоположительную при промежуточном значении соотношения ОПr/ОПк.
Данные анализа стандартной панели положительных сывороток ( по результатам ИФА с использованием набора фирмы "Ortho") больных гепатитом C и хронических носителей вируса гепатита C с помощью данной тест-системы (получившей название "Гепа-Скан") представлены в табл.1.
Приведенные в таблице 1 данные свидетельствует о весьма высокой чувствительности разработанной тест-системы.
В таблице 2 представлены данные анализа стандартной панели отрицательных сывороток крови доноров и сывороток в группах больных, которые могли давать реакции при постановке ИФА.
Данные таблицы 2 показывают высокую специфичность тест-системы.
Таким образом, предлагаемый набор для иммуноферментного анализа, обладающий достаточной специфичностью и чувствительностью, позволяет проводить первичный массовый скрининг образцов сывороток или плазмы крови человека на присутствие антител к вирусу гепатита C, а также проводить диагностику гепатита C методом ИФА.
Пример 2. Набор для серологического исследования образцов сыворотки или плазмы крови на присутствие антител к индивидуальным белкам вируса гепатита C.
Штаммы бактерий E. coli-продуценты полипептидов HC117, HC82, HC88, слитных с бета-галактозидазой E. coli или свободных от нее, и продуцент бета-галактозидазы E. coli выращивают на среде LB с селективными добавками.
Полипептиды получают как описано в примере 1.
При изготовлении иммуносорбента для наборов готовят растворы вышеперечисленных полипептидов и КАг, каждый в виде отдельного раствора в 0,06 М карбонат-бикарбонатном буфере pH 9,6 в концентрациях 10,10,15,10 мкг/мл соответственно. По 100 мкл растворов полипептидов вносят в лунки полихлорвиниловых планшетов для иммунологических реакций и инкубируют при 10 12oC в течение 10 14 часов.
Конъюгат пероксидазы хрена с белком A St. aureus или с анти IgG антивидовыми моноклональными антителами получают при помощи периодатного окисления с последующей хроматографической очисткой готового конъюгата. Конъюгат, контрольные сыворотки и буферную смесь с гидроперитом (БСГ) для пероксидазной реакции лиофилизируют в ампулах, запаивают в атмосфере инертного газа. В качестве контрольного положительного иммунореагента используют сыворотку крови человека или животных, содержащую антитела к вирусу гепатита C. В качестве контрольного отрицательного иммунореагента (K-) используют сыворотку крови человека или животных, не содержащую антитела к вирусу гепатита C.
Иммуносорбент перед использованием трехкратно промывают раствором ФСБ-Т, удаляют влагу из планшета. В 78 из 96 лунок вносят по 90 мкл раствора для разделения сывороток, оставляя 8 лунок пустыми для положительных (K+) и отрицательных (K-) контрольных сывороток.
Добавляют по 10 мкл предварительно разведенных (1:10) исследуемых сывороток в каждую из 4-х лунок горизонтального ряда (например, сыворотку N1 в лунки A1, 2, 3, 4). Содержимое лунок перемешивают пипетированием или с помощью встряхивателя. В незаполненные ряды в соответствии с фиг.1 вносят K-, K+ по 100 мкл в каждую из 4-х лунок.
Планшет заклеивают пленкой и выдерживают в течение 60 минут при температуре 37oC.
Содержимое лунок удаляют, затем планшет 5-ти кратно промывают и полностью удаляют влагу. Во все лунки планшета вносят по 100 мкл конъюгата. Планшет заклеивают новым листом пленки и выдерживают в течение 60 минут при температуре 37 o C.
Содержимое лунок удаляют, планшет 5-ти кратно промывают и полностью удаляют влагу. В каждую лунку планшета вносят по 100 мкл 0,05% ортофенилендиамина в растворе БСГ. Планшет помещают в защищенное от света место на 15 20 минут при температуре 15 25oC. Реакцию останавливают внесением во все лунки по 50 мкл 2N серной кислоты.
Регистрацию проводят немедленно на спектрофотометре типа "Мультискан", измеряя оптическую плотность (ОП) при длине волны 492 нм. Выведение спектрофотометра на нулевой уровень осуществляют по воздуху или по чистому сухому планшету.
Вычисляют среднее значение ОП (ОПср) для K-, которое должно быть не более 0,2; ОПср K+ в пределах от 0,8 до 1,8. Для каждой сыворотки вычисляют соотношение ОПr (в лунке с каждым сорбированными рекомбинантным антигеном) / ОПk (в лунке с КАг). Сыворотку учитывают как положительную, если соотношение ОПr/ОПk хотя бы для одного рекомбинантного антигена равно или превышает 4. Сыворотку следует считать отрицательной, если соотношение ОПr/ОПk для всех рекомбинантных антигенов меньше 2,0. Сыворотку учитывают как слабоположительную при промежуточном значении соотношения ОПr/ОПk.
Для каждой сыворотки вычисляют соотношения ОП по каждому рекомбинантному антигену к ОП по контрольному антигену. Сигнал по антигену учитывают как положительный, если соответствующее отношение превышает коэффициент 4. Сигнал по антигену учитывают как отрицательный, если соответствующее соотношение меньше коэффициента 2. Промежуточный вариант учитывают как сомнительный.
Данные анализа стандартной панели положительных сывороток (по результатам ИФА с использованием набора фирмы "Ortho") больных гепатитом C и хронических носителей вируса гепатита C с помощью данной тест-системы представлены в табл.3.
Результаты сравнительного исследования сывороток с помощью набора фирмы "Ortho" и вышеописанной тест-системы показывают, что данная тест-система не только обладает высокой чувствительностью и в 43 случаях из 43 (100%) подтверждает инфицированность больного вирусом гепатита C, но и позволяет дать расшифровку обнаруженных антител (к Cor-антигену, NS3 и NS4 белкам), что является определяющим моментом для назначения соответствующей терапии и определения прогноза заболевания. Кроме того, как видно из данных таблицы 3, в некоторых случаях в сыворотках крови обнаруживаются антитела только к одному из используемых полипептидов. Например, в сыворотках NN 4, 8, 10, 24 к полипептиду HC117, в сыворотке N18- HC82, в сыворотках NN 24, 25 HC88. Это свидетельствует о том, что в определенных случаях выявление антител к вирусу гепатита C можно проводить с помощью одного из представленных белков либо HC117, либо HC82, либо HC88, слитных с бета-галактозидазой или свободных от нее.
В качестве твердого носителя для нанесения рекомбинантных антигенов могут быть использованы не только планшеты для иммунологических реакций, но и любая другая твердая фаза. Например, полистироловые шарики, нитроцеллюлоза, латекс, эритроциты и др. В этих случаях рекомбинантные антигены выделяют тем же методом, что и в примерах 1 и 2, используют те же, либо другие иммунохимические реакции (например, агглютинации) и результаты учитывают как спектрофотометрически, так и визуально, либо при помощи других приборов.
В качестве реагента для выявления антител к вируса гепатита C может быть использован конъюгат пероксидазы хрена (или любого другого маркерного белка, например бета-галактозидазы или щелочной фосфатазы) с белком A St. aureus или с анти IgG антивидовыми моноклональными антителами или анти IgM антивидовыми моноклональными антителами.
Таким образом, данное изобретение позволяет определить спектр антител к индивидуальным вирусным белкам, что необходимо для проведения научно-исследовательских работ с целью установления закономерностей появления антител к определенным антигенам вируса гепатита C на различных этапах острой и хронической инфекции и прогнозирования процесса развития заболевания, разработки и оценки эффективности методов лечения гепатита C.
Использование: серологическое выявление вируса гепатита С человека. Сущность: получение диагностического набора, с помощью которого определяют наличие антител к вирусу гепатита C в крови инфицированных людей. Набор содержит роекомбинантные полипептиды со свойствами антигенов вируса гепатита С, полученные с помощью методов генной инженерии при использовании штаммов-продуцентов, трансформированных рекомбинантными ДНК, содержащими участки генома вируса гепатита С человека. Данный набор обладает высокой чувствительностью и позволяет определить спектр выявляемых противовирусных антител. 2 з.п. ф-лы, 3 табл. 5 ил.
полипептид НС82 структуры
и полипептид НС88 структуры
которые адсорбированы на твердом носителе в смеси или по отдельности.
| СПОСОБ СТАБИЛИЗАЦИИ ГАЛОИДСОДЕРЖАЩИХ УГЛЕВОДОРОДОВ | 0 |
|
SU318216A1 |
| Способ гальванического снятия позолоты с серебряных изделий без заметного изменения их формы | 1923 |
|
SU12A1 |
