Способ определения молекулярно-массового распределения лектинов и гумусовых соединений почвы Советский патент 1992 года по МПК C12P19/00 

Изобретение относится к экспериментальной микробиологии, а именно к способам определения молекулярно-массового (ММР) распределения биологически активных веществ, преимущественно-гумусовых соединений почвы и бактериальных лектинов,

Известно определение ММР гумусовых веществ при адсорбции на геле гуминовых кислот чернозема.

Известно также использование метода гельхроматографии для определения молекулярных параметров (молекулярной массы (ММ), ММР и П) гумусовых соединений почвы (фульво-кислот, гуминовых кислот); к недостаткам следует отнести плохую сопоставимость результатов по кривым ММР и расчитанным по ним с помощью маркеров значениям ММ и ММР.

Известны способы определения молекулярной массы белков при центрифугировании в градиентах плотности различных растворов. Однако они не могут быть использованы в связи с возможностью взаимодействия гумусовых веществ или лекги- нов с компонентами градиентов.

Наиболее близким к предлагаемому способу является способ определения мо- лекулярно-массовой неоднородности биологически активных веществ (микробных полисахаридов), включающий градиентное центрифугирование в комбинированном градиенте плотности солей NaCI и CsCR3, взятых в соотношениях (5:1)-И:1) (V/V) при постоянном суммарном объеме, причем плотность NaC 1,03-1,2 г/см3 и CsCI 1,2-1,6 г/см3, обеспечивает диапазон по ММР-20 103-2 106.

Недостатком способа является невозможность одновременного определения физико-химических параметров биологически активных веществ,

Целью изобретения является упрощение способа.

Для этого при разделении биологических активных ве цеств и растворов стандартов ММ (декстринов, полиэтиленгликолей) используется градиент плотности растворов

(Л

юе-Jk

о со ел х|

NaCI p 1,005 - 1.2 г/см3, при h 25000- 35000 об/мин, Т - 4-20°С в течение 3-5 ч. Использование в качестве градиента плотности NaCI ( Р 1,005-1,2 г/см3) позволяет определить ММ в диапазоне 500-110000. Метод дает возможность изучать нативные неочищенные препараты, минуя ряд этапов очистки, и одновременно анализировать от 3 до 9 ряД этапов очистки, и одновременно анализировать от 3 до 9 проб.

Исследования ММР биологически активных веществ проведены на гумусовых соединениях из почвы и внеклеточных лек- тинах одного из представителей рода В. mesenterfcus (Subtllis).

Гумусовые соединения извлекали из почвы 0,1 н. раствором пирофосфата в растворе NaOH. Исследовались образцы почвы, обогащенной: сахарозой, крахмалом и микробными полисахаридами: глюканом из Rlzoblum japonlcum шт. 16, глгокоманнаном из Xanthomonas PV. Phasioll. Содержание органического углерода в исследуемых образцах колебалось от 11,4 до 12,4 мг/г почвы.

Образцы лектинов получали из культу- ральной жидкости В. presentericus (subtllls) фракционным высаливанием сернокислым аммонием при 40 и 70% насыщении (препараты Л1 и Л2 соответственно). В качестве стандартов использовали: декстраны с молекулярной массой 13,7 106, 20 10, 40- 1,70-106и110 106;полиэтиленгликоли с ММ 600. 1500, 4000, 6000 В случае необходимости использовали сахарозу с ММ 348 и раффинозу с ММ 532,

Пример 1. Показывает неизменность гидродинамических параметров исследуемых препаратов: полисахаридов, которыми обогащали почву и лектинов в присутствии растворов солей NaCI. Гидродинамические свойства препаратов изучали в водных растворах и в растворах 0,005: 0,01 М NaCI с использованием аналитической ультрацентрифуги методом скорости седиментации - седиментация при п 58000 об/мин, а диффузия при п 4000 об/мин расчеты значений вели общепринятыми методами. Полученные значения приведены в табл.1. Незначительное отклонение молекулярных параметров связано с допустимыми погрешностями расчета констант седиментации, диффузии, молекулярной массы по уравнению Сведберга

М

SjoWRT

(1 -9p)D§0W где V - берут по Гольцвзрду (0,68).

Следовательно в присутствии 0,01 М растворов NaCI молекулярные характеристики изучаемых биологически активных веществ (гумусовых соединений почвы и

бактериальных лектинов) стабильны, что свидетельствует о правомерности изучения биологически активных биополимеров в условиях предлагаемого градиента плотности растворов NaCI.

Пример 2. Показывает ММР марке- ров-декстранов с ММ 15 106, 20 10е. 40 106, 70 - 106. 110. полиэтиленгликолей с ММ 1,5 106, 4 106, 6 106 и углеводных компонентов органического вещества почвы, обогащенного биозоном в градиенте плотности NaCI 1,005-1,2 г/см3, взятых в различных соотношениях по объему, при п 25-35000 об/мин в течение 3-5 ч (фиг. 1-3). На фиг,1 и 2 показано ММР маркеров.

Кривая ММР а (обозначенная -о-о) (фиг.2) получена при режиме п 35000 об/мин, t 5 ч и захватывает интервал ММ 1,5 106, 4 106, 6 106, 20 106, 40 - 106 и 70 106. Кривая ММР в (-) и с (..х...х) (фиг.2) получены

при режиме п 30000 об/мин, t 4 х и дают четкий интервал разделения по ММ в интервале 13 106-110 106.

На фиг.2 представлены следующие кривые ММР: а -(о-о-) получена в режиме

п ЗОООО об/мин, и четкий интервал в ММР отмечается в диапазоне 13 10-110 Ю5. Вместе с тем кривая ММР в (-), полученная в режиме п 20000 об/мин и t 6 ч, не имеет четкого распределения. Кривая ММР с

(...х ,.х.„) получена при режиме п 50000 об/мин и t 2 ч. Необходимо отметить, что в интервале ММ 40-110 106 информация теряется вследствие того, что маркеры осаждаются на дно.

На фиг.З показано распределение углеводных компонентов органического вещества почвы; обогащенного биозоном - гликан. Криаь-е ММР отражают режимы: а - п 35000 об/мин, t 54,6-n 25000

об/мин, t 3 ч, в - п 30000 об/мин, t 5 ч, с - п 50000 об/мин, t 2 ч. при постоянном суммарном объеме градиента NaCI - V 5 мл. Так на кривой ММР а - показана возможность расширения нижнего диапазона

границы. Определение ММ проводится при использовании по объему раствора NaCI с более низкой плотностью, а в качестве маркеров полиэтиленгликолевой с ММ (1,5 106, 4 106, 6 Ю6), а также декстранов ММ

15 Ю6, 20 Ю6, 70 10б. 110 Ю6. Кривые ММР б, в, с показывают зависимость четкости ММР от р- лима опыта, при средневесо- вой ММ оСрозца 63-58 10б. Только в более четко дг( i представление об истинном молекулярном распределении данного образ- цз - это его оптимальный режим разделения. Следует заметить, что значительное увеличение времени или скорости центрифугирования, не дзэт улучшения получаемых результатов для данного градиента плотности.

Пример 3. Показывает возможность использования предлагаемого способа для анализа ММР внеклеточных лектинов в нз- тивном неочищенном состоянии, выделенных из культуральной жидкости продуцента В. mesentericus (subtilis) высаливанием (NH2)S04 при 40% и 70% насыщении (препараты соответственно Л1 и Л2).

При этом центрифугирование проводили в режиме: п 30000 об/мин, t 3 ч, при V 5,5 мл в ступенчатом градиенте Nad ( pi 1,2-0,5 мл,/32 1,1-0,5 мл,/) з 1,05-0,5 мл, /04 1,03-0,5 мл, р5 1,02-0,5 мл, /os 1,01-0,5 мл и /) 1,005-0,5 мл на препаративных ультра центрифугах: , К-32 и БЕКМАН Л-6. В качестве маркеров использовали декстраны фирмы Флюка с ММ 13,5 10 20 106, 40 106

д

и 110 10 . Учитывая возможности центрифуг в одну из пробирок помещали маркеры, а в остальные 2-5-8 - исследуемые образцы. После окончания центрифугирования образцов или маркеров во фракциях определяли качественное и количественное содержание углеводов (фенол-серным методом). При построении кривых ММР по оси Y откладывали интенсивность поглощения при Л 490 им, а по оси X - номер фракции. На фиг.4 и 5 приводятся кривые, где а - маркеры, с - образцы. Наличие в образцах белковой составляющей в молекуле лектинов определяли методом Лоури и строили аналогичные кривые ММР -фиг.4 и 5 в, где по оси Y отмечали количественное содержание по белку, Кривые по ММР оценивались как в качественном аспекте, так и в количественном.

Данные кривых ММР препаратов лектинов свидетельствуют о том, что в препарате Л1 доминирует компонент с ММ 14-15 106 с незначительными примесями компонентов с ММ 60 и 70 106; в препарате ЛИ преобладает компоненте ММ 21-25 ° 106, в этом препарате имеется незначительное количество компонентов с ММ 40 106, 70 106и 110 106.

Применение предлагаемого способа позволило показать, что лектины В. messntericus (subtilis) представляют собой гпикопротеины с различной ММ и небольшой степенью полидисперсности, при этом

в препарате Л1 - содержится больше углеводных, а в ЛИ - белковых компонентов

Пример 4, Показывает использование предлагаемого способа опредечения

ММР для изучения молекулярных параметров гумусовых соединений почвы. На примере темно-каштановой среднесуглинистой слабосолонцеватой почвы исследовалась динамика распределения углеводных компонентов по фракциям гумусовых соединений, отличающихся своими характеристиками. Исследуемую почву обогащали различными полисахаридами, отличающимися по химическому составу: глюкан - из Rizobium

japonlcum шт. № 16 (фиг.6). Глюкомзнан из Xanthomonas pv. phasloli (фиг.7 и 8), и определяли обогащенность углеводами различных фракций гумусовых соединений а динамике 1, 2, 3 и 15 сут. Исследуемые образцы 7-9 получали по одной методике. При оценке процессов разложения, деструкции структурирования в данной серии опытов остановились на следующем режиме: п 30000 об/мин, ступенчатый градиент

плотности IMaCI созданный при pi 1,005- 1,2 г/см3, /32 1,2-1 мл, /33 1,1-1,5 мл; рА 1,05-1 мл; /95 1,03-1 мл; ре 1,02-0,5 мл V: ре 1,005-0,5 мл V).

Наличие маркеров и углеводов во фрэкциях исследуемых почв определяли фенол- серным методом, при этом образцы изучали как окрашенные, так и не окрашенные, результаты совпадали. Это показано на примере образцов почвы, обогащенной

бактериальным глюканом из Rizobium japonicum шт. № 16 (см. фиг.6 и табл.2).

Пользуясь методическим подходом Орлова расчета ММ, процента по ММ при анализе кривых ММР, получены результаты по

кривым ММР фиг.6-8. Более подробно рассматриваются образцы 7-9 - контроль (фиг.6, табл.2; фиг.7, табл.3; фиг 8 табл. 4).

Полученные результаты образца Rizobium japonicum шт. 16 (табл.2, фиг.6) показывают, что в процессе трансформации микробных полисахаридов, внесенных в почву, на первых этапах (фиг.6) потребление углеводов из низкомолекулярных фракций, при более глубоком разложении, кривая

ММР (фиг.6) начинается использование Сахаров и средних высокомолекулярных фракций.

Анализ кривых фиг.7 и 8 проводили по вышеприведенной схеме.

Полученные данные позволили проследить, как в темно-каштановой почве происходят процессы деструкции полисахаридов, фрагментарного обновления гумусовых соединений, которые находят отражение в изменениях: процентном соотношении тех или иных молекулярных массовых компонентов.

Пример 5. Показано соответствие результатов, полученных при использовании предлагаемого метода для анализа бактериальных лектинов и метода дискэ- лектрофореэа в ПААГе в присутствии Na-до- децилсульфата.

На фиг. 9 и 10 показано распределение белковых компонентов с различной ММ. Так, в препарате Л1 (фиг.9) преобладает компонент с ММ в пределах 12 106 - 14 106 (124,1 и 106,6), а в препарате ЛИ фиг.11 компоненте ММ 23 10-26 10 (значения 104,5 и 101,3). В обоих препаратах лектинов имеются компоненты и с другой ММ. Формула изобретения

Способ определения молекулярно-массового распределения лектинов и гумусовых соединений почвы, предусматривающий фракционное разделение образцов, отличающийся тем, что, с целью упрощения

способа, фракционирование проводят ступенчатым градиентным центрифугированием в растворе NaCI плотностью 1,005-1.2 г/см при частоте центрифугирования 25000-35000 об/мин в течение 3-5 ч

Изобретение относится к экспериментальной микробиологии, а именно к способам молекулярно-массового распределения биологически активных веществ, в частности пектинов и гумусовых соединений почвы. Цель изобретения - упрощение способа. Дпя этого проводят ступенчатое градиентное центрифугирование градиента плотности раствора NaCI при плотности 1,005-1,2 г/см3 и скорости центрифугирования 25000-35000 об/мин в течение 3-5 ч. 10 ил.

Экзополисахарид из Rizobium japonicum шт.16

Экзополисахарид из Xanthomonas fuecans pv. phasidi

Маннам

Препарат Л10,03

B.mesentericus

(subtills)(4,6:1)

Препарат Л2

B.mesentericus1,4

(subtilis)(3,9:1)

имечание. S,W - константа седмиментации;

Ъ°,W - константа диффузии;

Концентрированный раствор - 0,01 М NaCI, соответствует плотности 1/2 г/см3.

Таблица 1

1,8.10

-г

4,5-Ю 7

, „ .--7

6,0-10

5,

4,0-10

-7

1,Э Ю 2,0-10

--б

-6

1,2-10-J 7,5-107

68000 в И20

40000 в 0,005М NaCI

30000 в HgO

35000 в 0,01М NaCI 80000 в П20 78000 в 0.01М NaCI 14000 в Н20

15000 в 0.01М NaCI

21000-24000 в Н20 25000 в 0.01М NaCI

Таблица2

Средневесовые молекулярные массы - Ш углеводов в различных фракциях гумино- вых соединений почвы, обогащенной глюканом из Rizobium japonicum шт.16 (по данным обработки кривых ММР (фиг.7)

6 очиенный

6

|це

1, 2

2,3,4

4,5,6,7

7,8,9JO,M Т,2

2,3,А

4,5,6

6,7,8,9,10

10,11,12,13

13,14,15

До 13,710 20-10 40-Ю6 70 О О

до ТзТтоо1

20 -106 40106 70-Ю6

б

(70-110)10 110 Ю6

,

6,

1,2 2,3,4,5

6,7,8 8,9,10 10,11,12 12,13,И,15

До 13,7 Ю6I2,0

20-Ю6II15,5

МЫ О6III60,0

ifO-70.106IV1,5

, 70.10е2,5

(70-110} ,4

110-Ю615

I

II III IV

I

II

III

IV

,6

25,3

14,1

W.7

15,3

б,8

7,8

10,7 50,0 15,0

35280

76500

52200 MS/D 40000

ТаблицаЗ

Средневесовые молекулярные массы - Ш углеводов в различных фракциях гумусовых соединений почвы, обогащенной глюкоман- наном Xanthonionas f us cans pv.phasioli

13

Средневесовые молекулярные массы - Ш углеводов в различных фракциях гумусовых соединений почвы - контроль (полученные по данным обработки кривых НИР (фиг.7)

10

Ло 13,7 ЮЬ 20-Ю6 40.-106 110106

i.

10,11 ,14

10

Ло 13,7нс1

; 20ИО

40-106

70-Ю6

70-110

110,00

6

До 13,7-10 20-10 40Ч06 70-Ю6 110-Ю6

Ло 13,7-Ю 20 «10е 40 Ю6 70 10е ltfl 10

1Г

Mr

1 2 3 if 5 6 7 8 ЭЮЯПШЪ 151ST 18 N фракций ФШ

1756357

14

Таблица

13,6 и,3

-27,2

31,4

13,6

54010

1

I

II

III

VI V

I II

III

IV V

9,3 9,2

10,7

41,1 16,1

I3 1

nTz

9,о

9,0

30,3

40,4

58113

72630

I

II

III

IV V

12,0

10

39,1

33,6

5,2

Ц8680

э

«5.

С5 Ј5 .СЭ Я

1ЧЭ -4 Ч

S

j &

% 3

7 I 3 4 5 6 7 8 ЭЮ11П13П ISlb mS N cppawuu

0,2f 0,1

..-x--x .

121-4-5678 310ЯП13№ W Ю Ш819 fa фракции 15-2Qr Wr | i 170т

.-X

ФигА

белок, 4 ; г 3 5 6 Т 8 3 Ю11ППМ15ЮП 18 мг

плп,

г

мл flj-b

Q.I

ai

1 г з 5 67 в аюппяю 51бп

12 345678$ 10 11 ЦП ЯП ПИ 1В

Фив. 5

Зв

Фракций

лп}ивн/ф Sf/

J-OU

OZ6181U91SIUЈIZIU016 9 L 9 S Ь f Z I

..„. .- -J L-n|-.n-| ф- I II - Ц -j --j- - - j..-J. 1 j .. j 111 I |imw- i. -TT- --j--vTTr-- IT

(ЛЪМ00Ф 9# ц gi Qi Ы Јt 21U Oi 6 8 L 9 S b Ј I I

isegsit

Щ ОЬ I 01-91

SO Q

I Q

910

I Q

Ј10

№ гы J

ptoHoubitf mu9i$ttiiuiiiioi8 a L 9s ь Ј г /

Ц|. И. g...i..gЦ1|у, I ц и i ,,.,,j1,)-Jр

V 4 гЖ/..J

ш

OL

ш ш-а

.„U&llUQl 6В I 9 G Ј г I

t.-t-..- t. 1- 1И-И--tН--1И-Г -IГ

J O

от

Ј&

(jra

га

/. гы :

со to ю r

fftt-

- OQ-OBl

/ЯГ/

00 Wl J X3

9 ZB

MS-««.-.

OO OS

DDKV

OQDO O