Способ регуляции биосинтеза белка в растении Советский патент 1992 года по МПК A61K35/64 

Изобретение относится к физиологии растений и к биохимии, а именно к способам регуляции биосинтеза белка в растении.

В настоящее время к вопросам регуляции различных метаболических процессов в растительных клетках, в частности синтезу белка, уделяется большое внимание. Регуляция биосинтеза осуществляется торможением или стимулированием отдельных этапов синтеза белка, поэтому важен поиск новых регуляторов.

Из научной литературы известно физиологически активное соединение интерферон человека, являющийся полипептидом и стимулирующим синтез белка в листьях пшеницы. При увеличении концентрации интерферона происходит снижение эффективности синтеза белков в растении (Влияние интерферона человека и (2-5)

олигоаденилатов на синтез белков в тканях растений. Каплан И.Б., Малышенко С.И. и др. ДАН СССР, 1987, т. 297, № 4, стр. 1018).

Известен фузикокцин - токсин гриба Fusicoccum, обладающий стимулирующим действием на синтез РНК и белка (Влияние фузикокцина на синтез РНК в листьях ячменя in vivo и in vitro. Новикова Г.В., Д.Г. Муромцева, Романенко Е.Г., Селиванкина С.Ю., Кулаева О.Н. Физиология растений, 1987, 34, вып. 6, стр. 1121-1127.

Известно, что абсцизовая кислота, фи- тогормон, являющаяся природным ингибитором, в зависимости от физиологического состояния растения наряду с ингибировани- ем может стимулировать синтез белка, (Влияние абсцизовой кислоты на синтез РНК и активность РНК полимераз в листьях ячменя. Романко Е.Г., Селиванкина С.Ю., Курое А Ј

V,

О

а

дов В.А., Овчаров А,К. и др. Физиология растений, 1984, 31, вып. 2, стр. 294-300.

Из патентной документации известны регуляторы биосинтеза белка, например: полипептид, полученный из специфических аллергенов и обладающий иммунодепрес- сантной активностью (заявка №2134908 Великобритания (В) МКИ А 61 К 39/36, 39/35, С 07 К7/00 Изобретения стран мира, вып. 60,ч. 1,№2, 1987), низкомолекулярный полипептид, выделенный из головного мозга млекопитающих и проявляющий ингибиру- ющее свойство на рост клеток (заявка № 86/04239 РСТ (WO) МКИ А 61 К 37/00, С 07 К 7/00, Q 01 N 33/53 Изобретения стран мира, вып. 15, Ns 5, 1987), пептид, обладающий активностью ингибитора пролиновой эндопептидазы (заявка № 61-183297 Япония (JP) МКИ С07 К5/08, А 61 К37/02. 37/64, С 12 N 9/99 Изобретения стран мира, вып. 60, № 1, 1988), пептид, полученный из яда или секретирующего эпителия ядовитых змей, обладающий способностью ингиби- ровать рост клеток (пат. № 4672107, США (И) МКИ С 07 К 15/00 Изобретения стран мира, вып. 60, Ms 7, 1988).

Прототипом предлагаемого изобретения является рицин, белковый токсин из клещевины обыкновенной. Лектины, куда относится рицин, содержатся не только в растениях, они встречаются и в тканях беспозвоночных. У растений и беспозвоночных животных лектины, вероятно, функционируют как защитные белки, предохраняя эти лишенные иммунной системы, а следовательно, и антител организмы от вторжения паразитарных микроорганизмов. Рицин - сильно действующий яд, вызывает 50% ин- гибирование синтеза белка клеток А 431 при концентрации 1, М, Большинство известных в настоящее время лектинов токсично для клеток животных in vitro, но их токсичность в 1000-2000 раз ниже токсичности рицина (А, Ленинджер). Основы биохимии. М., Мир, 1985 г., с. 348; Лектины растений: Предлагаемые функции. Марков Е.Ю., Хавкин Э.Е. Физиология растений, т. 30, вып. 5,1983, с. 852). Herley R. Herschman The role of binding ligand in toxic hybrid proteins: A comparison cf EGF-ricin, EGF- ricin A-chaln, and rlcin, Biochemical and biophysical research communic, 1984, v. 124, №2, c. 551-557.

Недостатком выбранного нами в качестве прототипа рицина в силу его токсичностиявляетсяограниченностьфункциональных возможностей.

Целью изобретения является расширение функциональных возможностей.

Цель достигается тем, что в способе регуляции биосинтеза белка в растении в качестве регулятора используют белок, выделенный из пены личинок цикады-пенницы слюнявой Aphrophora costalis Mats, этим регулятором ингибируют синтез белка в растении в концентрации 17 10 мг/мл - 17 10 мг/мл, а стимулируют в концентрации мг/мл -34 10 мг/мл.

0 Из научной литературы и патентной документации известны способы регуляции синтеза белка в растении за счет применения регуляторов различной природы. Не известны авторам (за исключением

5 фитогормонов) регуляторы, позволяющие при одних концентрациях стимулировать процесс биосинтеза, а при других ингибиро- вать. Существенным отличием предлагаемого способа является использование в

0 качестве регулятора синтеза белка растений соединения, выделенного из дешевого природного сырья - экскретов личинок цикады. При этом использование его в разной концентрации позволяет регулировать про5 цесс биосинтеза белка растений.

На фиг. 1 показана гель-фильтрация на колонке с сефадексом-25.

На фиг. 2 показано хроматографическое разделение белка методом ВЭЖХ.

0 Таблица 1. Характеристика белков - пи- ков-экскрета, полученных ВЭЖХ.

Таблица 2. Ингибирование синтеза белков зерновок пшеницы.

Таблица 3. Регуляция биосинтеза,белка

5 редиса.

Таблица 4, Регуляция биосинтеза белка в листьях пшеницы.

Способ регуляции биосинтеза белка в растении заключается в том, что в качестве

0 регулятора биосинтеза используют белок, выделенный из экскретов цикады-пенницы слюнявой Aphrophora costalis Mats. С этой целью к пене добавляют небольшими порциями при постоянном перемешивании

5 сульфат аммония в виде сухой соли до полного насыщения. Сформировавшийся сульфат - аммонийный осадок белка отделяют центрифугированием при 15 000 об./мин в течение 30 минут при t +4°C на центрифуге

0 типа 317 в (Poll and). Осадок растворяют в минимальном объеме 0,1 М Na-форфатного буфера, рН 6.8, содержащего 0,1 М NaCI. Полученный раствор обессоливают с помощью гель-фильтрации на колонке 1,6x20

5 см с сефадексом G-25 (Pharmacia), уравновешенной исходным буфером. На колонку наносят по 2 мл белкового раствора и ведут элюцию со скоростью 50 мл/час. По поглощению при 280 нм, регистрируемому уви- кордом фирмы LKB определяют начало

выхода белка, имеющего максимум поглощения в УФ-области при данной длине волны (пик 1 - фиг. 1). Фракции белка собирают по 2 мл. При появлении в элюенте сульфата аммония (пик 2 - фиг. 1), обнаруживаемого по качественной реакции с BaCl2, сбор белка прекращают. Фракции с раствором белка, свободного от сульфата аммония, объединяют и используют для дальнейшей работы (пик 1 - фиг. 1).

Обнаружено, что каллусные ткани, выращиваемые на среде с полученным белком, погибли через 20 часов после начала опыта (наблюдался полный некроз пересаженных кусочков каллусной ткани), в то время как надосадочная жидкость, содержащая все остальные соединения экскрета, не оказала влияния на прирост биомассы каллуса (102% от контроля).

Применение полученного белка приводило к ингибированию синтеза белка различных растений (таблица 3, 4), а именно, корней редиса на 60%, листьев редиса на 70%, листьев пшеницы на 62%.

Для выяснения фракционного состава белков использовалось хроматографиче- ское разделение их методом ВЭЖХ. Было получено пять фракций с молекулярными массами от 800 кД до 1 кД (фиг. 2). Молекулярные массы белков определялись с использованием стандартных маркеров фирмы Serva (табл. 1). Концентрации полученных белков определялись хроматогра- фическим методом (табл. 1). Физиологическая активность белков пиков исследовалась на зерновках пшеницы.

П р и м е р 1. Зерновки пшеницы в фазе молочной спелости помещали в чашки Петри. В каждую чашку заливали по 5 мл раствора белков каждого пика и добавляли 50 мл раствора 14С-лейцина с радиоактивностью ЗЗ Си/мл. В растворе зерновки находились 1 ч, затем их отмывали несколько раз дистиллированной водой и фиксировали жидким азотом, Образцы лиофильно высушивали. Растворимые белки выделяли из растительного материала (навеска 20 мг) последовательной экстракцией 2% KCI, 75% спиртом, 0,2% NaOH. Объем каждого растворителя был равен 2 мл. Экстракцию проводили при 4°С в течение одного часа. Белки выделяли центрифугированием в течение 15 мин при 10 тыс. об/мин. Для полноты извлечения белков экстракцию с каждым раство- рителем проводили 4-5 раз. В надосадочной жидкости определяли содержание белка по методу Лоури-Фолина и включение 14С-лейцина в белки на жидкостном сцинтилляционном счетчике Дельта- 300 (США).

Как видно из данных табл. 1, белки 4 пиков (2-5) проявляли физиологическую активность, а именно, ингибировали включение 14С-лейцина в белки зерновок, в то

время как белок 1 пика не оказывал влияния на синтез растворимых белков.

П р и м е р 2. Действие полученного регулятора синтеза белка проверяли на листьях и корнях редиса. Для этого двух и

0 трех-дневные проростки редиса помещали в чашки Петри на предварительно смоченную фильтровальную бумагу. В каждую чашку Петри раскладывали по 40 растений и заливали 10 мл белка. В растворе белка рас5 тения находились в течение двух часов, затем их отмывали холодной дистиллированной водой. В пробирки с растениями добавляли по 2 мл раствора С 14-Д, L-лейцина и выдерживали в течение двух

0 часов. Образцы отмывались холодным раствором немеченного лейцина. Растения редиса расчленялись на листья и корни. Пробы фиксировались жидким азотом, лиофильно высушивались, растирались в порошок. Для

5 выделения белка навеску растительного материала по 40 мг растирали в 2 мл 0,1 №- фосфатного буфера, содержащего 0,1- М NaCI,pH 6,8. Экстракцию проводили при t +4°С в течение одного часа и затем центри0 фугировали 15 мин при 10000 об/мин. В надосадочной жидкости определяли содержание белка по Лоури и включение 14С-лей- цина в него (на жидкостном сцинтилляционном счетчике Дельта-300,

5 США). Разведение белка в диапазоне концентраций от 17-Ю 2 мг/мл до 17 мг/мл приводит к снижению включения 14С-лейци- на в растворимые белки листьев и корней редиса (табл.3). Происходило ингибирова0 ние синтеза белка корней редиса от 60% до 5%, и листьев от 70% до 8%. Далее разбавляли белок от концентрации 34 Ю мг/мл до мг/мл 0,1 М Na-фосфатным буфером рН 6,8 содержащим 0,1 М NaCI. Как

5 видно из таблицы 3, у корней редиса стимулирующий эффект наблюдался при концентрации белка от 34 10 мг/мл (110% от контроля) до мг/мл (106% от контроля) с максимумом 145% от контроля при

0 концентрации белка мг/мл, у листьев редиса - при концентрации белка от мг/мл (105% от контроля) до мг/мл (102% от контроля) с максимумом 164% от контроля при концентрации белка

5 мг/мл.

Примерз. Действие белка как регулятора синтеза белка проверяли на листьях пшеницы. Для этого листья 4-х дневных растений пшеницы помещали по 20 штук в каждую пробирку и заливали по 2 мл белка.

Дальнейшая последовательность обработки растений проводилась, как описано в примере 2. Разведение белка в диапазоне концентраций от 17 мг/мл до 17. мг/мл приводит к снижению включения 14С- лейцина в растворимые белки листьев пшеницы (табл. 4). Происходило ингибирование синтеза белка листьев пшеницы от 62% до 6%. Действие разбавления белка приводило к стимуляции синтеза белка листьев пшеницы от 148% до 215%, как видно из табл. 4.

Результаты исследований свидетельствуют о том, что разбавленный белок действует как стимулятор синтеза белка, причем, при уменьшении концентрации белка происходит усиление стимулирующего эффекта.

Дополнительным подтверждением биологической активности белка являются данные, полученные при изучении его влияния на прирост биомассы каллуса эпикотиля сои.

П р и м е р 4. Первичный каллус получали из отрезков стебля асептических выращенных 4-х дневных проростков эпикотиля сои сорта Волна. Эксплантанты длиной 3 мм помещали на среду следующего состава: минеральные соли по Мурасиге-Скугу, никотиновая кислота (РР) - 0,5 мг/л, пиридок- син-HCI (Be) - 0,5 мг/мл, тиамин - HCI (Bi) - 0,1 мг/л, мезоинозит - 100 мг/л, глицин - 2 мг/л, НУК - 2 мг/л, БАП - 1 мг/л, сахароза - 30 г/л, агар - 9 г/л, рН - 5,6-5,8. Культуру выращивали в темноте при 26°С и пересаживали каждые 3 недели. Разбавленный бе- лок наслаивали на поверхность агаризованной питательной среды (по 2 мл

на 1 чашку Петри d - 90 мм), используя мембранные фильтры. В контрольные варианты наслаивали дистиллированную воду или буфер. Интенсивность роста каллуса определяли через 21 день по весу сырой массы клеток.

Следует подчеркнуть, что каллусные ткани, выращиваемые на среде с добавлением исходного белка (17. мг/мл), погибли через 20 часов после начала опыта (наблюдался полный некроз пересаженных кусочков каллусной ткани).

При разбавлении белка до концентрации 34 10 мг/мл наблюдался максимальный привес каллусной ткани - 14,24 г на грамм внесенного каллуса, что составило 163% от контроля.

Предложенный способ позволяет удешевить научные исследования по изучению

регуляции синтеза белка в растении. Кроме того, новизна регулятора биосинтеза белка в растении в предложенном способе, позволит оптимизировать рост каллусных тканей

Формула изобретения

Способ регуляции биосинтеза белка в растении путем воздействия на него пептидным соединением природного происхождения, отличающийся тем, что, с целью унификации способа, используют белок, выделенный из пены экскретов личинок Aphrophora costalis Mats, причем для инги- бирования биосинтеза раствор белка берут

в концентрации 17 10 2-17-10 мг/мл, а для стимулирования биосинтеза - в концентрации -34-10 ° мг/мл.

Изобретение относится к физиологии растений и к биохимии, в частности к способам ингибирования и стимулирования биосинтеза белка в растени. Сущность изобретения: для ингибирования биосинтеза используют раствор белка, выделенного из экскретов личинок Aphrophora costalis Mats, в концентрации 17-10 2-17. мг/мл. Для стимулирования биосинтеза берут раствор того же белка в концентрации 34-10 4- 34«10 6 мг/мл. 2 ил., 4 табл.

Способ регуляции биосинтеза белка в растении

i а б л и ц а 1

Способ регуляции биосинтеза белка в растении

Таблица2

ТаблицаЗ

Способ регуляции биосинтеза белка в растении

Таблица4

го

Г

«ч

ж о cs

и ш

0

с

ь о

с:

5 U

6Q 90 ЭД i,MW«.