Способ обнаружения цитоплазмы НеLIаNтнUS ретIоLаRIS в клетках НеLIаNтнUS aNNUUS Советский патент 1993 года по МПК C12Q1/68 

Изобретение относится к сельскому хозяйству, в частности к селекции и семеноводству подсолнечника.

Цель изобретения - упрощение процедуры/уменьшение затрат и сокращение времени обнаружения цитоплазмы Hellantus petiolaris в сортах, гибридах и линиях Helianthus annuus, позволяющий сохранить проанализированные растения для дальнейшей селекционно-генетической работы.

В селекци.и подсолнечника широко ис- пользуется скрещивание культурного Helianthus annuus и дикого Н.petiolaris видов подсолнечника. Гибридизация производится с целью создания форм с цитоплазмитической мужской стерильно- стью.и передачи ряда хозяйственно-ценных признаков от дикого к культурному виду. Для идентификации цитоплазмы обычно необходимо выращивание растений и оценка морфологических признаков, в то время как такая информация часто необходима до посева растений.

Установлено, что цитоплазма различных видов содержит митохондрии, характеристики которых могут в известной мере различаться. Так, митохондриальнзя ДНК культурного подсолнечника в отличие от Н,petiolaris содержит специфическую плзз- мидоподобную ДНК (Brown С., Bussey H., DesRosiers L. 1986). Молекулярно-биологи- ческая технология позволяет выделить эту ДНК и ввести в состав бактериальной плаз- миды для создания зонда - молекулярного маркера.

Молекулярная ДНК:ДНК гибридизация позволяет с высокой чувствительностью и надежностью выявить материал, содержащий плазмидоподобную митохондризль- ную ДНК Н.annuus. Dot -гибридизация делает возможным анализ большего количества образцов. Это имеет большое значение для семеноводства гибридного подсолнечника. В случае механического смешения семян закрепителей стерильности и мужски-стерильных форм предлагаемый метод позволяет оценить степень загрязнения материала, обозначить закрепители и стерильные формы и высеять их отдельными рядами в оранжерее или в поле.

(Л

С

ч о

-ч о

ю

01

GO

Таким образом, мы предлагаем биотехнологический способ для определения цитоплазмы H.annuus и H.petlolarls, который состоит в том, что кусочки растительной ткани раздавливаются на мембранных фильтрах с последующей щелочной денатурацией и гибридизацией со специфическим ДНК- зондом. Детекция цитоплазмы на принадлежность к H.annuus или H.petlolarls осуществляется по наличию или отсутствию авторадиографического сигнала соответственно.

Пример. Для идентификации цитоплазмы H petlolarls в сортах, гибридах и линиях H.annuus использовали 6-8-дневные проростки. Для этого 20-40 мг тканей анализируемых растений (корни, проростки) раздавливали стеклянной палочкой на мембранном фильтре. Для лизиса клеток из раздавленных тканей и связывания с мембраной, освобождающейся из клеток денатурированной ДНК гомргенат ткани обрабатывали 10 минут раствором 0,5 М NaOH. Фильтр промывали 50 мл трис-HCI, рН 7,5 и кипятили 5 мин, в 1,5% растворе SDS для снижения неспецифического связывания и уменьшения фона. Остатки ли- зированных тканей удаляли механически ватой, смоченной 1,5% раствором SDS. Фильтры сушили на воздухе, а затем при 70°С в вакуумном шкафу.

Предгибридизацию фильтра проводили в запаянном полиэтиленовом пакете в 4xSSC, 0.5% SDS, 10 х Денхардт (50 х раствор содержит 5 г фикола, 5 г поливинилпир- ролидона, 5 г БСА, 500 мл НаО) в течение 1 -6 часов при 64°С. Для гибридизации фильтр инкубировали в минимальном объеме того же раствора с 3-5х106 имп/мин зонда в течение ночи при 64°С. Отмывку после гибридизации проводили в 4-5 сменах 0,2xSSC, 0,5 SDS с последующим экспонированием фильтра на рентгеновской пленке в течение 16-72 часов и проявлением.

Исходным материалом для получения зонда послужила плазмидоподобная ДНК названная РЛГ-плазмидой, выделенная из митохондрий, H.annuus, линия Од-1076. Плазмиду разрезали по сайту Sau ЗА и лиги- ровали по Bam HI сайту с плазмидой риС 18. Клетки культуры NM-522 трансформировали продуктами рестрикции лигирования. Селекцию клонов вели на LB-среде с ампи- циллином в присутствии x-gal и Iptg. Pe- комбинатную плазмиду разрезали реетриктазой EcoR I. В качестве зонда ис- пользовали большой фрагмент плазмидо- подобной ДНК, расположенной между сайтами рестрикции для EcoR I (рис. 1,2).

Рис. 1. Лигирование плазмид риС 18 и PIT рестриктировэнных Bam HI и Sau ЗА соответственноРис.2. Рестрикция рекомбинантной плазмиды.

1. маркер: риС 18, рестриктаза EcoR I - верхняя полоса,

риС 1.8, рестриктаза Bgl I - две нижние полосы,

0 2. нерестриктированная рекомбинантная плазмида/

3. рекомбинантная плазмйда, рестриктаза EcoR I (в качестве зонда используется нижний фрагмент))

5 4. рекомбинантная плазмйда, рестриктаза Bgl I

5. рекомбинантная плазмида, рестриктаза Pst l%

Рис.3. Авторздиограмма гибридизации 0 тотальной ДНК из тканей H annuus со специфическим зондом (клонированный фрагмент плазмидоподобной ДНК из митохондриальной H.annuus).

Верхний ряд - корни, нижний ряд - про- 5 ростки;

1. линия Од-543 (цитоплазма H.annuus) .

2. линия ЦМС Од-543 (цитоплазма H.petlolarls)

3. линия Од-1036 (цитоплазма

0

H.annuus)

4. линия ЦМС Од-1036 (цитоплазма H.petlolaris);

5. линия Од-69 (цитоплазма H.annuus) 5 6. линия ЦМС Од-69 (цитоплазма H.petlolarls))

7. линия Од-3369 (цитоплазма H.annuus),

8. Линия ЦМС Од-3369 (цитоплазма H.petlolarfs)

0 Рис.4. Авторадиограмма гибридизации тотальной ДНК из корней H.annuus со специфическим зондом (фрагмент плазмидоподобной ДНК из цитоплазмы H.petlolarls).

а.в.д.ж - ЦМС - растения линии 1036 с 5 цитоплазмой H.petlolarls;

б.г.е.з - фертильные растения линии ... 1036с цитоплазмой H.annuus,

В процессе лигирования возможно образование двух типов рекомбинантных 0 плазмид рис. 1 а, б. В качестве зонда использовали фрагмент рекомбинантной плазмиды, расположенный между EcoR сайтами, как это показано на рис. 1а.

Введение метки в зонд осуществляли 5 ник-трансляцией с использованием 32Р- dNTH и ДНК-полимеразы 1 из Е.соН.

На рис.3 представлена авторадиограмма, полученная после гибридизации фильтра с меченым зондом. На фильтре была фиксирована ДНК из проростков и корней

H.annuus с цитоплазмами H.annuus и H.petlolaris. Позитивный сигнал свидетельствует о присутствии в цитоплазме анализируемого растения плазмидоподобной ДНК, а значит, принадлежности ее к H.annuus, Негативный сигнал говорит о принадлежности цитоплазмы исследуемого растения к H.petiolarls.

На рис.4 представлена авторадиограмма, выполненная аналогично авторадиог- рамме, представленной на рис.3, для корней40 анализированных растений, 20 из которых несли цитоплазму H.petiolarls, a другие 20 - Kannuus.

0

Таким образом, для определения цитоплазмы H.annuus и H.petlolaris разработана биотехнологическая система дифференци- ровки, основанная на Dot-гибридизации. Молекулярная ДНК:ДНК гибридизация позволяет детектировать соответствующую радиоактивному зонду плазмиду в составе тотального препарата. Особенностью метода является создание зонда - детектора цитоплазмы H.annuus и технология его использования для участков тканей растений, что позволяет их использование в дальнейшей селекционной или семеноводческой практике.

Использование: в сельском хозяйстве при селекции и семеноводстве подсолнечника. Сущность изобретения состоит в том, что осуществляют гибридизацию тотальной ДНК из раздавленных тканей со специфическим зондом, сконструированным на основе EcoRI-EcoRI-фрагмента ДНК Helianthus annuus, размером 1200 н.п. 4 ил.

Формула изобретения Способ обнаружения цитоплазмы Helianthus petiolarls в клетках Hellanthus annuus, включающий фиксацию клеточного материала растений на мембранных фильтрах, проведение ДНК-гибридизации с фиксированным материалом, оценку

полученных результатов, отличающий- с я тем, что, с целью упрощения способа, на мембранных фильтрах фиксируют тотальную ДНК, а гибридизацию проводят с ДНК- зондом, который представляет собой - EcoRI-EcoRI фрагмент митохондриальной ДНК Helianthus annuus размером 1200 н.п.

3 / f

ФигЗ..

W

& .

.

:ft

&:

.

6

7 8

,т

Ш

т