Штамм гибридных культивируемых клеток MUS мUSсULUS L., используемый для получения моноклональных антител к трансферрину человека Советский патент 1992 года по МПК C12N5/00 C12P21/08 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для изготовления иммуносорбента с целью выделения и очистки трансферрина человека.

Известны штаммы гибридных клеток, продуцирующие моноклональные антитела (МКА) к трансферрину человека 1,2. Однако в указанных работах рассматриваются лишь свойства самих МКА и не дается описания каких-либо признаков гибридом, продуцирующих эти МКА. Кроме того, не содержится сведений о взаимодействии МКА с близкородственными и сопутствующими белками (альбумином, гемоглобином и С-реактивным белком) в тканях и биологических жидкостях,

Целью изобретения является получение нового штамма культивируемых гибридных клеток мыши, продуцирующего МКА, которые выявляют трансферрин в биологических жидкостях и тканях человека.

Штамм получают следующим образом Мышей линии Balb/c иммунизируют подкожно 50 мкг трансферрина человека, растворенного в 0,01 М Na-фосфатном буфере с 0,14 М NaCI, pH 7,2 (ФБС) мульгированно- го в полном адьюванте Фрейнда в объеме 1:1 (по 0,5 мл на мышь). На 21 и 42 день иммунизацию повторяют и через 21 день после последней иммунизации проводятбу- стирова ние, вводя внутривенно (в хвостовую вену) 100 мкг трансферрина человека, растворенного в ФБС (по 0,5 мл раствора на мышь). Бустирование повторяют в последующие два дня и через один день после последнего проводят слияние клеток следующим образом.

К осадку клеток при постоянном встряхивании пробирки по каплям добавляют раствор полиэтиленгликоля - 1000 (50% ростовой среды Игла в модификаши Дульбеко (DMEM)c 10% диметилсульфо пдг) (DMSO)

Х|

СП

ю

00 XJ

ю

1 мл в течение 1,5 мин). Затем пастеровской пипеткой в течение 5 мин по каплям и при постоянном встряхивании добавляют среду DMEM без сыворотки 10 мл. Смесь клеток центрифугируют (1500 об/мин, 5 мин), осадок ресуспендируют в среде DM ЕМ с сывороткой. Суспензию клеток раскапывают в лунки 96-ячеечных плат с макрофагами (104), внесенными туда накануне. Концентрация клеток миеломы в микроплатах составляет 104 клеток на лунку, спленоцитов - 10 клеток в 100 мкл среды. Платы помещают в С02-инкубатор (6% С02, 37°С). После 24-часовой инкубации в каждую лунку микроплат с клетками (общий объем среды в лунке 150 мкл:50 мкл среды с макрофагами и 100 мкл среды с миеломными клетками и спленоци- тами) добавляют по 50 мкл 4-кратной среды ГАТ с бромистым этидием в концентрации 1 мкг/мл, Среда ГАТ включает, мкг/мл: гипо- ксантин 136; аминоптерин 0,18 и тимидин 3,78. Кормление клеток осуществляют путем замены половины среды в лунках.

В результате скрининга полученных гибридов по признаку продукции антител к трансферрину, последующего их клонирования и реклонирования отбирают штамм, стабильно продуцирующий МКА к трансферрину. Штамм хранится в Специализированной коллекции клеточных культур Института цитологии АН СССР под номером 452Д и характеризуется следующими признаками.

Штамм культивируется на ростовой среде Игла в модификации Дульбеко (DMEM) с добавлением 10% сыворотки эмбриона коровы, а также 1 мМ заменимых аминокислот, 1 мМ пирувата натрия, 2 мМ глутамина, 5 х мМ 2-меркаптоэтанола и 40 ед./мл гентамицина.

Клетки культивируют при 37°С в инкубаторе в атмосфере 5-7% СОг или в герметических флаконах в термостате без подачи С02. Способ культивирования - суспензионный. При росте на указанной среде штамм образует округлые клетки. Время удвоения популяции - 36 ч. Кратность рассева 1:2 при пересеве через 48 ч. Посевная доза 150 тыс. клеток в 1 мл, максимальная плотность популяции 800 тыс. клеток в 1 мл. Клонирование клеток приводят в 96-ячеечных платах без добавления фидерных клеток. При посеве 3-4 клеток в лунку эффективность составляет 70%. Способность к продукции МКА сохраняется на протяжении 20 пассажей в культуре клеток.

Криоконсервацию проводят в эмбриональной сыворотке коровы с добавлением 10% диметилсульфоксида (DMSO) при концентрации 1 х 106 клеток в 1 мл. Иммуноспособность клеток после размораживания - 70%.

Прививка культивируемых гибридных

клеток штамма 452Д сингенным мышам (линия Balb/c, 106 клеток на мышь) вызывает у

них образование асцитной опухоли Клетки

прививаются со 100%-ной эффективностью

и эксплантируются на опухоли в культуру. В

асцитной жидкости содержатся МКА к

0 трансферрину.

Продуктивность штамма. При стандартных условиях культивирования штамма 452Д п vitro титр антител в среде, кондиционированной клетками гибридомы (супер- 5 натайте), составляет 1:104. Титр МКА в асцитной жидкости, определенный с помощью Е, составляет 10 .

МКА, продуцируемые клетками штамма 52Д в культуральную среду, специфически 0 связываются с трансферрином человека, что показано с помощью стандартного им- муноферментного анализа, а также методом иммуноблотинга. Продуцируемые МКА не связываются с гемоглобином, альбумином и 5 С-реактивным белком человека. При проведении радиальной иммунодиффузии в ага- розе МКА к трансферрину не образует линий преципитации.

С помощью стандартных специфиче- 0 ских антисывороток установлено, что МКА, продуцируемые штаммом 452Д, относятся к изотипу lgG1.

Пример 1. Для получения МКА клетки штамма культивируют во флаконах Корреля 5 емкостью 100 мл на среде DMEM с добавлением 10% эмбриональной сыворотки коровы, 1 мМ заменимых аминокислот, 1 мМ пирувата натрия, 2 мМ глутамина, 5 х М меркаптоэтанола и 40 ед./мл гентамицина 0 при37°Си5-7% С02.

Посевная доза 1,5 х 105 клеток/мл. Пересев проводят через каждые 2 дня с помощью пипетирования. При пересеве клетки штамма стерильно отделяют центри- 5 фугированием (3000 об/мин, 5 мин) и используют для дальнейшего культивирования, а среду, кондиционированную клетками штамма (супернатант), стерильно сливают. Таким образом проводят 20 пасса- 0 жей.

С помощью стандартного иммунофер- ментного анализа (ELISA) устанавливают, что супернатант содержит МКА к трансферрину человека. Для этого к трансферрину (3 5 мкг/мл в 0,2 М бикарбонатном буфере, рН 9,5), сорбированному в лунках платы для иммунологических исследований (по 50 мкл в каждой) добавляют промытый дистиллированной водой и фосфатным буфером (0,01 М фосфатный буфер с 0,14 М NaCI и 0,05%

Твин-20, рН 7,2) (ФБР) супернатант в разведении и инкубируют 2 ч при комнатной температуре. Затем промывают водой и ФБР и добавляют в каждую лунку по 50 мкл конъюгата кроличьих антимыши- ных антител с пероксидазой хрена в разведении 1:500. Через 1 ч платы промывают водой и ФБР и добавляют по 50 мкл субстрата (0,1 % ортофенилдиамин, 0,03% Н200, 0,2 М цитратный буфер, рН 4,5) в каждую лунку. По окончании ферментативной реакции расщепления НаОо в присутствии орто-фе- нилендиамина при наличии МКА развивается желтая окраска, которую регистрируют на спектрофотометре Мультискан при дли- не волны 450 нм. Связывание МКА с транс- феррином человека обнаруживают при разведении супернатанта до .

Отсутствие взаимодействия полученных МКА с гемоглобином, альбумином и С- реактивным белком человека определяют следующим образом. В часть лунок 96-лу- ночной платы наносят по 50 мкл каждого используемого антигена (трансферрина, альбумина, гемоглобина и С-реактивного белка человека) в концентрации 3 мкг/мл карбонатного буфера (0,2 М NaaCOa, 0,2 М №НСОз, рН 9,5) и инкубируют 1 ч при 37°С. Затем платы промывают следующим образом; ополаскивают дистиллированной во- дои, закапывают по 200 мкл ФБС (0,1 М Na-фосфатный буфер, 0,14 М NaCI, рН 7,2) с добавлением 0,05% Твин-20 (ФБР), выдерживают 3 мин и еще раз ополаскивают дистиллированной водой. В последующем все промывания осуществляют подобным образом. После промывания во все лунки наносят среду, кондиционированную гибридными клетками по 50 мкл на лунку и инкубируют 2 ч при комнатной температуре. Далее платы промывают вышеописанным способом и наносят антимышиные иммуноглобулины кролика, конъюгированные с пероксидазой хрена и разведенные 1:100 в ФБС, инкубируют 1 ч при комнатной темпе- ратуре, промывают и вносят в лунки по 50 мкл раствора субстрата (10 мкг 0-фенилен- диамин, 10 мл 0,1 М цитратный буфер, рН 4,5, 4 мкл 30% НаОо) и инкубируют 30 мин при комнатной температуре. В случае поло- жительной реакции наблюдается желтое окрашивание лунок. Измерение экстинции индивидуальных ячеек проводят при 450 нм с помощью автоматического прибора.

Результаты измерений приведены в таблице.

Результаты, приведенные в таблице, свидетельствуют о том, что полученные МКА специфически взаимодействуют с транс- феррином и не связываются гемоглобином,

альбумином и С-реактивным белком человека.

Пример 2. Готовят пробы для имму- ноблоттинга. Белки (трансферрин, альбумин, гемоглобин и С-реактивный белок человека) помещают в буфер для проб (0,125 М Трис-HCI, рН 6,8, 2% додецилсульфат натрия, 10% глицерин) и нагревают30 мин при 56°С. Затем подвергают электрофорезу в 12 %-ном полиакриламидном геле по методу Лаэммли (напряжение 40 В, 4 ч). Затем одну часть геля фиксируют в смеси изопропанол (25%), уксусная кислота (10%). вода остальное в течение 3 ч, окрашивают в том же растворе с добавлением 0,1 % амидо черного 10 В и осветляют в фиксирующем растворе.

Другую часть геля используют для проведения злектрофоретического переноса белков из геля на нитроцеллюлозный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм. Перенос белка на нитроцеллюлозу проводят при токе 500 мА в приборе для электроблоттинга в электродном буфере: 25 М Трис. 192 М глицерин, 20% (1:1) метанол. рН 8,3 в течение 1,5 ч. Качество переноса оценивают путем окрашивания геля, использованного для электропереноса белков. В данных условиях наблюдается практически полный перенос белков. После электропереноса проводят иммунологическое выявление белков на нитроцеллюлозе. Для этого элек- трофоретические блоты ополаскивают раствором ФБС и вымачивают в растворе ФБС с добавлением 0,3% Твина-20 (ФБСТ) 1 ч при 37°С. Блоты разрезают пополам, Одну часть используют в качестве контроля неспецифического связывания антимышиных иммуноглобулинов кролика, конъюгирован- ных с пероксидазой хрена, и инкубируют с культуральной средой DM ЕМ с добавлением 10% эмбриональной сыворотки. Другую часть блота инкубируют со средой, кондиционированной гибридными клетками без разведения. Инкубацию проводят 18 ч при 4°С. После инкубации обе части блота промывают раствором ФБСТ четыре раза по 5 мин и инкубируют с антимышиными иммуноглобулинами кролика, конъюгированными с пероксидазой хрена в разведении 1:1000 в ФБСТ 1 ч при комнатной температуре, промывают ФБСТ 4 раза по 5 мин, 1 ч в ФБС и добавляют субстрат (20 мг диаминобензи- дин, 0,6 мл 0,1 М имидазол, 10 мкг 30% Н200. 19,4 мл ФБС, рН 7,2). Инкубируют 20 мин,

Реакцию останавливают, промывая блоты дистиллированной водой. Гели и блоты фотографируют на пленку Микрат-300. На пленке наблюдается только одна полоса

связывания МКА, соответствующая транс- феррину человека. При этом в контроле не- специфическое прилипание вторых антител отсутствует. Таким образом, полученные МКА специфически узнают транс- феррин человека.

Пример 3. Синтез грансферрина - одна из многих тканеспецифических функций печени. При различных заболеваниях печени в диагностических целях представ- ляет интерес охарактеризовать временную и пространственную организацию данной функции в ткани печени, оценить долю клеток, синтезирующих трансферрин, которые могут меняться в ходе развития поражения органа. Подобный подход позволяет выявить нарушение функции и прослеживать динамику функционального состояния гепа тоцитов и печени в целом. МКА по сравнению с традиционными цитохимическими методами позволяют с высокой чувствительностью и точностью выявить индивиду- альные антигены и, в частности, трансферрин в ткани печени, и таким образом открыть возможности в дифференци- альной диагностике заболеваний печени, Трансферрин выявляют в ткани печени следующим образом.

Кусочки печени от двух человек (относительная норма и хронический гепатит}, пол- ученные путем прижизненной пункционной биопсии, фиксируют в 4% формалине, на 0,1 М фосфатном буфере, рН 7,4 в течение 2 ч, промывают в том же буфере, обезвоживают в спиртах восходящей концентрации, про- водят через хлороформ и заливают в парафин. Приготавливают срезы толщиной 5 мкм. Перед иммуногистохимическим анализом проводят депарафинирование в 2 сменах ксилола (по 3 мин) и регидратируют в нисходящих по крепости спиртах (по 3 мин в каждом). Промывают в ФБС. Для подавления собственной пероксидазной активности срезы после 100° спирта (перед 96° спиртом) инкубируют в метаноле с 0,3% НаОо в течение 30 мин.

Поело промывки в ФГтС срезы инкубируют в ФЬС с добавлением О, I % CTI онина 1 ч, ополаскивают в ФБС и инкуОиоуют с МКА без разведения 30 пин В качестве контроля неспецифпчрского связывания вю- рчхантител срезы параллельно инкубируют без первых антител с ФБС

После прпмыртния в ФЬС (3 раза по 5 мин) срезы инкубируют г вторЫ( in змтитела- ми - антимышинымн пммуноглоЬ, ипами кролика, коныогировячными с пероксидз- зой хрена в разведение 1 100 о ФБС в течение 30 мин. После промывания о cDBC (4 раза по 5 мин) инкубиоуют с суб трлтом {1 мг диаминобен идина (ДАВ) г-л Трио-ЧС рН 7,5 4 мкл 30% ) 10 мин ь темноте Далее промыва or в ФпГ (3 раза по 5 мин) и усиливают реакци г г о i % С «-См в течение мин, сатеч си р их nv а ют в ФБС (3 раза по г ,-, rfj ,ST - спиртах вссход чцгй КПЦР, |«гг м (по J раза в каждом), осяетляю 5 2 сменил силола (поЗ мин) и заключают в бальзам Срезы фотог раФиру or m грмбсое f/o г фок- вант, объекте х 2го течь а (Ликраг-ЗОО .

Результаты исследорании г оказывают, что не наблюдается ,меского связывания KiMTf j }J ix гнтит я тсгда кэк при обработке срезов практически все гепа- тоциты в разной сгегени выраженности, особенно при поражении , содержат трансферрин, i с наблюдается оеекая гетерогенность гепатоиитов по спдержанию трансферрит по сравнению с относительной нормой

Таким образом, полученные МКА специфически выявляют грлисферрин человека в биологических жидкостях и тканях человека и могут быть использованы в диагностических целях

Формула изобретения Штамм гибридных культивируемых клеток Mus musculus L , h 452Д, используемый для получения моноклональных антител к трансферрину человека

Использование: биотехнология и медицина, выделение и очистка трзнсферрина человека. Сущность изобретения: получение штамма гибридных культивируемых клеток мыши, продуцирующего монокло- нальные антитела (МКА) к трансферрину человека, не дающие перекрестных реакций с близкородственными белками. Штамм получают гибридизацией спленоцитов мыши линии Balb/c с клетками мышиной миеломы Sp EBR-5. МКА относятся к lgG1, их титр в культуральной жидкости составляет 1:10 , в асцитной - 1:107. МКА не связываются с гемоглобином, альбумином и С-реактивным белком человека.