Штамм гибридных культивируемых клеток MUS мUSсULUSL, используемый для получения моноклональных антител к рекомбинантному @ - фактору некроза опухолей человека Советский патент 1992 года по МПК C12N5/00 C12P21/08 

да, в течение 1,5 мин. После гибридизации и отмывания клеток от полиэтиленгликоля, клетки высевают в 96-луночные панели по 1 105спленоцитов в лунку. Для культивирования и селекции гибридом используют среду IMDM (модифицированная Iskove s среда Дульбекко) с добавлением 10% эмбриональной телячьи сыворотки (ЭТС), 10 М гипоксантина, 4 М аминоптерина и 1,6 М тимидина. Гибриды-продуценты клонируют один раз методом конечных разведений, высевая по 1 клетке на лунку, содержащую клеток селезенки. После клонирования практически 100% субклонов продуцируют МКА к ра-ФНО. Продукция антител сохраняется как минимум в течение 15 пассажей в культуре. Штамм получил условное обозначение ЮРМ.Он хранится в ЭТС с добавлением 10% диметилсульфок- сида в жидком азоте. Штамм продуцирует МКА G2a изотипа, обладающие специфичностью к а-ФНО человека, Секреция моно- клональных антител на 3-4 день культивирования составляет 100-125 мкг/мл культуральной среды.

Использование штамма иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Гибридные клетки помещают в стеклянный флакон объемом 50 мл по клеток в 5 мл среды IMDM с 10% ЭТС, 2мМ L-глютамина, 100 мкг/мл пенициллина и стрептомицина, 0,05 мМ меркап- тоэтанола. Клетки культивируют 2-3 дня при 37°С в атмосфере 5% С02. МКА выделяют из полученного супернатанта аффинной хроматографией на колонке с иммобилизиро- ванным рекомбинантным белком A St. aureus Cowan I и используют в иммунофер- ментном анализе (ИФА). ра-ФНО, р/Ј-ФНО и бычий сывороточный альбумин (БСА) в количестве 0,3 мкг в 100 мкл 0,1 М карбонатного буфера (рН 9,5) вносят в 96-луночные микроплаты и оставляют на ночь при 4°С. Отмывают водопроводной водой и вносят 1 мкг МКА в 100 мкл 0,1 М фосфатного буфера (рН 7,4), содержащего 0,15 М NaCI, 1 % БСА (ФСБ-БСА). Инкубируют в течение 1 ч на встряхивателе. После отмывания инкубируют с меченными пероксидазой к иммуноглобулинам мыши антителами в разведении 1:2000 на ФСБ-БСА в течение 1 ч. Ферментную реакцию проводят в течение 10 мин. Раствор субстрата представляет собой 0,1 М цитратный буфер (рН 4,7) с 0,6 мг/мл ортофенилендиамина гидрохлорида и 0,01% перекиси водорода. Реакцию останавливают через 10 мин 1М серной кислотой и учитывают на спектрофотометре с

вертикальным лучом при длине волны 492 нм.

Результаты эксперимента по изучению специфичности связывания МКА, продуци руемого клетками штамма 10FN, с антигенами, иммобилизированными на пластике, представлены в табл.1.

Результаты исследований свидетельствуют о более высокой специфичности МКА,

продуцируемых клетками штамма 10FN по сравнению с прототипом, и подтверждают возможность применения данных МКА для определения ра-ФНО человека с помощью иммуноферментного анализа.

П р и м е р 2. Меченные биотином МКА используют в конкурентном ИФА с адсорбированным на твердой фазе р а-ФНО человека в присутствии двух концентраций немеченных антител.

На 96-луночной полистироловой плате для ИФА адсорбируют ра-ФНО (2 мкг/мл) в 100 мкл 0,1М бикарбонатного буфера (рН 9,5) в течение ночи при +4°С. Неспецифическое связывание блокируют раствором

ФСБ-БСА. После каждой инкубации плату пятикратно отмывают ФСБ, содержащим 0,01% Твина 20. Разведенные раствором ФСБ-БСА биотинированные МКА смешивают с различными-концентрациями немеченных антител. Смесь добавляют в лунки и инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре на встряхивателе. После отмывания добавляют конъюгированную с ави- дином пероксидазу (разведение 1:2000 на

ФСБ-БСА) и инкубируют в течение 1 ч. Затем плату отмывают и проводят ферментную реакцию в течение 10 мин, как указано. Результаты исследований представлены в табл.2.

Результаты, представленные в табл.2, свидетельствуют о том, что МКА 10FN в некоторой степени подавляют связывание МКА 3C7N с р а-ФНО человека, адсорбированным на пластике, и не препятствуют взаимодействию с антигеном МКА АО. Таким образом, МКА штамма tOFN и 3C7N распознают неидентичные, частично перекрывающиеся эпитопы. Эпитопы, распознаваемые МКА 10FN и АО, различны,

П р и м е р 3. Биологическую активность различных образцов ФНО определяют по лизису клеток мышиной фибробластоидной линии L929 в присутствии актиномицина D. Накануне теста клетки L929 рассевают по

50л 10 -на лунку в плоскодонные 96-луночные микроплаты в минимальной среде, модифицированной Дульбекко (ДМЕМ) с 5% ЭТС, глютамином, пенициллином и стрептомицином. В отдельной плате готовят разведения образцов ФИО в объеме 50 мкл, вносят равный объем соответствующего разведения антител и инкубируют 30 мин при комнатной температуре. После инкубации образцы переносят в плату с клетками L929, добавляютактиномицинОдо концентрации 1 мкг/мл и помещают в термостат с температурой 37°С на 20 ч. Результаты учитывают после окрашивания клеток 0,2%-ным раствором генцианвиолета в 20%-ном метаноле в течение 15 мин. Оптическую плотность лунок измеряют при длине волны 540 нм на спектрофотометре с вертикальным лучом. Снижение оптической плотности лунок соответствовало лизису клеток L929. За единицу биологической активности образцов ФИО принимают то их разведение, которое вызывает 50%-ный лизис клеток по отношению к интактным.

Результаты эксперимента по нейтрализации биологической активности р «-ФНО человека МКА штаммов 10FN, 3C7N и АО представлены в табл.3.

Данные табл.3 свидетельствуют о том, что МКА полученного штамма 10FN обладают наиболее высокой нейтрализующей активностью.

Кроме того, МКА 10FN нейтрализуют биологическую активность как рекомбинант- ного, так и природного or-ФНО человека (табл.4). Макрофагальный а-ФИО получен

нами при стимуляции моноцитов человека St. aureus до конечной концентрации в куль- туральной среде 0,001 % (по объему) в течение 18ч при37°С.

Данные этого примера свидетельству0 ют о равной степени эффективности нейтра- лизации биологической активности как рекомбинантного.таки природного с-ФИО человека.

Таким образом, предлагаемый штамм

5 продуцирует МКА к р а-ФНО человека в больших количествах по сравнению с известным. Полученные МКА обладают высокой нейтрализующей активностью и могут быть использованы для изучения антигенной

0 структуры и биологических эффектов а- ФНО человека In vitro и fn vivo, а также в процессе генно-инженерного производства а-ФНО.

Формула изобретения

5 Штамм гибридных культивируемых клеток Mus musculus L ВСКК(П) N 441Д, используемый для получения моноклональНых антител к рекомбинантному ее -фактору некроза опухолей человека.

Таблица 1

Таблица 2

)-выражена в ME p а-ФНО человека, нейтрализуемых 1 мкг Jq G

)-активность макрофагального а-ФНО человека составляет 235 ME/мл

) концентрация р-а-ФНО человека составляет Юнг/мл, что соответствует 750 МЕ/мл

Таблица 3

Таблица 4