Штамм культивируемых гибридных клеток животных МUSмUSсULUS L - продуцент моноклональных антител против В-лимфоцитов крупного рогатого скота Советский патент 1991 года по МПК C12N5/00 C12P21/08 

Изобретение относится к гибридом - ной технологии и может быть использовано для определения В-лимфоцитов коров о

Цель изобретения - получение штамма культивируемых гибридных клеток, продуцирующих моноклональные антитела (монАТ) против IgH коровы,

Ытамм получают следующим образом,.

Мышей Ва1Ъ/с весом 18-20 г иммунизируют В-лимфоцитами крови больного хроническим лимфолейкозом крупного рогатого скота (1СРС) , В-лимфоциты из крови животных выделяют методом аффинной хроматографии

Иммунизация включает цикл из инъекций В-лимфоцитами (2x10 кл/мл) внутрибрюшично в полном адъюванте Фрейда В процессе иммунизации у животных определяют титр антител к В-лимфоцитам КРС методом твердофазного ИМФ анализа „ Выход гибридом, гфодуцирукщих спе- циоические антитела, наибольший, если для слияния берут клетки на 3-5-е сутки после бустерной иммунизации

Для получения гибридомы используют клеточную линию миеломы РЗх x63Ag8.653. Клетки миеломы культи- - вируют на среде ДМЕМ с добавлением 10% сыворотки эмбрионов крупного рогатого скота, 2 мМ глутанина, 20 мМ буфера IIEPES, 200 мкг/мл гентамици- на0 При гибридизации в качестве сли- ваюцего агента используют 50%-ный

05 4

сд

1C

СО

ел

полиэтиленгликоль (ПЭГ) МсМ„ 15000 Родительские клетки миеломы P3x63Ag8.

.653 применяют в логарифмической фазе роста. Из селезенки Balb/с мышей, иммунизированных В-лимфоцитами, извлекают спленоцнты. Спленоциты и клетки миеломы промывают трижды в среде ДМЕН с двукратной концентрацией антибиотика (гентамицина) без снво- роткио Для слияния смешивают 10 клеток миеломы и 10 лимфоцитов селезенки мыии Ва1Ь/с„ Перед слиянием клетки смешивают и совместно осаждают центрифугированием при 1500 об/мин в течение 10 мин. К осадку клеток добавляют 0,3 мл ПЭГ, тщательно перемешивают и инкубируют 60 с. Далее клетки разбавляют средой ДНЕМ без сыворотки. Первые 10 мл среды добав- ляют в течение 10 мин, далее разбавление проводят быстрее, доводя объем до 100 мло Клетки центрифугируют 10 мин при 1500 об/мин. Осадок

I суспендируют в среде ГАТ с 20% сы- воротки эмбрионов крупного рогатого скота и помещают в 96-луночные платы из расчета 1-1,5x10 клеток миеломы на одну лункуо За день до гибридизации в лунки плат помещают макрофаги брюыной полости мышей по 1«10 - клеток в лунку. Платы с клетками инкубируют при 37°С в атмосфере 5%-ной На 14-е сутки среду ГАТ, в которой культивировали гибридные клоны, меняют в ГТ (гипоксантин 110 И, тимидин ), а затем на обычную среду культивирования„ Клоны, синтезируюыие антитела, переводят в 24-луночные платы, после чего замора- живают и клонируют методом предельных разведений в 96-луночных платахо Клетки, синтезируюцие. антитела (10 - 10 клеток на 1 мл), вводят в брюшную

.полость мыией Balb/c, обработанных пристанем (0,5 мл на мышь внутрибрю- шинно) за 4-10 дней до введения клеток для получения асцитов о

Отбор клонов проводят путем определения антител к В-лимфоцитам в Куль туральной среде, в которой росли клоны. Антитела определяют твердофазным иммуноферментным методом Титр антител в культуральной жидкости составляет 128.

..Штамм обозначен BBL-E и депонирован под номером ВСКК(П) ff 295D. Культуральные свойства.

5 0

5 0 , Q

$

0

5

Штамм культивируют на ростовой среде Игла в модификации Дульбенко (ДМЕМ) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 4 г/л глюкозы, 20 мМ буфера HEPES, 2 мМ глутами- на и 50 мкг/мл гентамицина. „

Клетки культивируют в суспензии в матрасах объемом 0,5 л; посевная концентрация 10 клеток/мл, кратность рассева 1:60

Прививка клеток мышам на разных пассажах культивирования стабильно вызывает образование асцитных опухолей у мыиейо

Образованию асцита способствует предварительная инъекция пристана животнымо Его вводят за 4-10 дней до введения клеток по 0,5 мл на 1 мышь, внутрибрюииннОо Суспензию гибридных клеток 10у- 10 (4 мл) на 1 мышь также инъекцируют внутрибрюыинно,, Опухоли образуются через 7-14 дней после прививкио От одного животного удается получить около 5 мл асцита, Мон- АТ высаливают 45%-ным раствором сульфата аммония с последующей очисткой на ионнообменной колонке с ДЭАЭ-целлю- лозой„ Концентрацию иммуноглобулинов определяют в 96-луночных планшетах для микротигровашик В лунки вносят 20 мкл исследуемого образца и добавляют по 200 мкл раствора для определения белка, содержащего 0,01%-ный раствор Кумасси Р-250, 5% этанола и 10% II.РО , Оптическую плотность измеряют через 5 мин на спектрометре (Бекман И-8В, СНА) при длине волны 620 нм„ В качестве стандарта для калибровочной кривой используют раствор мыпиного IgG в концентрации от 0,1 до 0,8 мг/мл„ Концентрации стандартного раствора определяют спектрофото- метрически при длине волны 280 нм с учетом коэффициента экстинкции В асците концентрация иммуноглобулинов составляла 5 мг/мл,,

Крноконсервацию проводят в среде ДМЕМ с 50% сыворотки эмбрионов крупного рогатого скота и 10% ДМСО„ Жизнеспособность замораженных клеток составляет 72-85% от общего числа клеток о

Характеристика полезного продукта.

Специфичность полученных монАТ определяют с помощью непрямого имму- ноферментного (ИМФ) и радиоиммунологического (РИА) чнализов. Анализы проводят на лимфоцитах, выделенных

из периферической крови здоровых (НЛ и больных хроническим лимфолейкозом (ЛЛ) коров о Полученные МКА проявляют специфичность в 5-6 раз выше к ЛЛ, чем к нормальным, а также специфически реагируют с белками сыворотки крови крупного рогатого скота (КРС)J а именно с IgM, выделенным из сыворотки КРСо

Для исследования молекулярной специфичности монАТ, продуцируемых штампом BBL-Dg, приготавливают колонку с иммуносорбентомо В качестве носителя берут сефарозу 4В, активированную бромцианомо На 1 мл егля берут 6 мг очищенных из асцитной жидкости. На приготовленный иммуно- сорбент наносят меченые J поверхностные белки НЛ и ЛЛ и инкубируют колонку 1 ч при 37°С, легко перемешивая „ Несвязанные белки элюируют 0,1 И боратным буфером рН 8,3„ Специфически связанные белки элюируют 0,2 М НС1-глициновым буфером, элюат нейтрализуют 1 М NaOH и диализируют против ФСБ.

Иодирование белков клеточной поверхности проводят с помощью лакто- пероксндази0 В суспензию клеток 5-10х107 в 1 мл ФБС добавляют 100 мкл лактопероксидазы (2 мг/мл), 40 1Шк Ма г53 и 100 мкл 0,03% Смесь инкубируют 4 мин, осторожно переметшая, и опять добавляют 100 мкл 0,03% НгОа„ Через 4 мин инкубации клетки 3 раза промывают ФСБ и лизируют 0,5%-ным раствором дезоксихолата натрия на боратном буфере, рН 8,3, имеющим 1 мМ PMSF (уенилметилсульфонилфторида)„ Эффективность мечения белков устанавливают с 10%-ной трихлоруксусной кислотой (ТХУ) , Установлено, что иммуно- сорбент с MICA специфически связывает 0,79% белков, снятых с НЛ, и 1,36% белков, снятых с ЛЛ0

Элюат с специфически связанными белками исследуют с помощью электрофореза в столбиках полиакриламидного геля в присутствии додецилсульфата натрия (ПААГ-ДСН)„ Используют 7,5% и 10% полиакриламидные гели„ В качестве буферной системы используют 0,025 М грис, 0,192 М глицина, 0,1% ДСН, рН 8,3 Белковые пробы перед электрофорезом разбавляют буфером нанесения в соотношении 4:1 и инкубируют в течение 2-3 мин в кипящей водяной бане.

5

0

5

,- 0

0 5

Буфер нанесения готовят, смешивая с. 0,5 11 трис-НС1,-рН 6,8, 0,9 мл 87% глицерина, 1,6 мл 10% ДСН, 0,4 мл 2-меркаптоэтанола, 0,2 мл 0,015% бромфенолового синего и дистиллированной воды до конечного объема 8 мл Электрофорез в концентрирующем геле проводят при постоянном токе 17 мА на гель При переходе краски в разделяющий гель силу тока увеличивают до 25 мА на гель.

Фиксацию и окрашивание геля проводят в течение часа в растворе, содержащем 25% этанола, 10% уксусной кислоты и 0,1% красителя .Кумасси Р-250. Гель отмывают в 25%-ном водном растворе этанола с 10%-ной уксусной кислотойр В качестве маркерных белков используют комплект маркерных белков для электрофореза: фос- форилазу (94 кДа), бычий сывороточный альбумин (67 кДа), овальбумин (43 кДа), карбоновую ангидразу (30 кДа), ингибитор трипсина (20,1 кДа), и J -лактальбумин (14,4 кДа), Пластинки гелей с мечен- .ными белками сушат под вакуумом и проводят радиоавтографию на пленке рентгенографической медицинской. Столбики гелей с мечеными J белками режут на кусочки по 2 им и измеряют излучение У -счетчиком (LKB) .

Установлено, что иммуносорбент специфически связывает поверхностные белки лимфоцитов, которые имели молекулярную эмассу около 83-90 килодаль- тоНо Из литературных данных известно, что такую молекулярную массу имеет тяжелая цепь поверхностного иммуноглобулина М„

Для проверки проводят ИОА отдельных классов иммуноглобулинов, очищенных из сыворотки крови КРС. В лунки 96-луночной пластинки разливают по 100 мкл отдельных классов Ig (IgM,, IgG 1 и IgG 2, концентрация 10мкг/мп) Б карбонатном буфере рН 9,6. Пластинки инкубируют 3 ч при комнатной тем- пературе, жидкость стряхивают, лунки, блокируют 0,4%-ным БСА 1 .ч при и отмывают 5 раз ФСБ с 0,05%-ным твин-20 После инкубации с монАТ (1 ч при 37°С) и с антителами к Ig мышей, мечеными пероксидазой, получают, что монАт специфически связывает только

IgHo

Установлено, что монАТ связывают IgM КРС, но не реагируют с IgM, вы

.к i i HIM из сыворотки крови крыс, кроликов и человека,, Этим показано, что монAT, продуцируемые штаммом RBL-D опознают специфические детерминанты на молекуле Igll, свойственные только IgM у КРСС

Определение класса и подкласса мопАТ проводят иммуноферментным методом, МопАТ BBL-D. принадлежат к классу 1цС2Ь.

При культивировании клеток штамма BBL-DQ in vivo в мышах линии Balb/c 01 одной мыии получают 1-5 мл асцит- ной жидкости. Из 1 мл асцитной жидкости получено 5 мг МКа. Титр антител в асцитной жидкости составляет . П48,

LlT.-iMM хранится в специализированной коллекции клеточных культур инсти тута Цитологии АН СССР - ВСКК.

Регистрационный номер депонирования ВСКК(II) К 295 D.

Использование штамма иллюстрируется следующим примером использо- ваиия 1донАТ BBL-D- в методах ИФА и Р11А для определения взаимодействия MoiiAT с клетками периферической кропи здоровых коров и больных лим- (ролей коз ом, а также с клетками из различных ломфоидпых органов (тимуса , костного мозга, эмбрнонных лим- (о июв и селезенки) „

1 р и м е р„ Для определения спе- щи- (носги мопАТ методом ИФА в асцитной /П1ДКОСТН и после их выделения из периферической крови здоровых и больных хроническим лимгюлейкозом коров ID L n- iMHir лимфоциты при 4°С в градиенте плотности 17%-ного верографина,, Выделенные клетки трижды отмьшают фосоатло-солевьсм буфером (ФСБ) рн 7, н с успендируют до концентрации

1x10 клеток/мл. Для экспериментальных исследований используют суспензи ашюоцитов, содержащие не менее 90% tni ux клеток с )(изнеспособность 1пм роцитов определяют с помощью (}305%-ного раствора трипанового сиш 106

Суспензию клеток (1x10 мл) по

j мкл разливают в лунки 96-луночной плоскодонной пластинкио Пластинки ле ю встряхивают, чтобы клетки равномерно распределились на дне лунок, и высупивают в термостате при 37 С„ Такие пластинки с прикрепленными клека DI можно хранить длительное время при +4°С0 Перед использованием лунки

регидратируют с 100 мкл ФСБ в течение 10 мин „ В лунки добавляют по 100 мкл ФСБ, имеющего 10 БСА, и инкубируют пластинки 1 ч при 37°С„ Пластинки отмьшают 5 раз ФСБ, содержащим 0,05 твин-20о В лунки вносят по 50 мкл мопАТ и контрольных сывороток: сыворотку мыией, иммунизированных ЛЛ (положительный контроль), и сыворотку здоровых мышей линии Balb/c (отрицательный контроль) в разведении 1:1000 Пластинки с антителами инкубируют при комнатной температуре 3 ч, а затем оставляют на ночь при +49С„ Пластинки вновь отмывают описанным выше способом и в лунки вливают овечьи антитела к Ig мышей, меченые пероксида- зой, в разделении 1:1000 В ФСБ с 1% БСАь Пластинки инкубируют 1 ч при 37 С, отмывают 5 раз и в каждую лунку вливают по 100 мкл субстрата АБТС (2,2 азино-диаэтилбензтиозолинсульфа- та)с Пластинки инкубируют 20 мин при 37°С в темноте„ Реакцию останавливают добавлением 100 мкл 2,1%-ного раствора лимонной кислоты Учет результатов проводят спектрофотуметром при длине волны 416 нм„ Па основе результатов анализа устанавливают,что титр асцитной жидкости составляет 2048, а оптимальная концентрация очищенного монАТ - 2-5мкг/мл„

Для определения специфичности монАТ методом радноиммунологического анализа (РИА) клетки лимфоидных органов и лимфоциты периферической крови (106/мл) разливают по 100 мкл в каж- дуи лунку и добавляют по 100 мкл МКА или контрольных антисывороток. Инкубируют 1 ч при 37 С и на ночь при 4 Со После инкубации пластинки центрифугируют при 1500 об/мин 5 мин, суперна- тант отсасывают, клетки 5 раз промывают ФСБ, В каждую лунку вносят по 50 мк (50„000 имп/мин) меченых J овечьих антител против Ig мыией (Amersham, Англия) и инкубируют 1 ч при 37°С„ После инкубации клетки промывают 5 ра ФСБ н определяют радиоактивность„Как метод ИФА, так и РИА показал, что моиAT связываются более интенсивно с лимфоцитами коров, больных лейкозом, чем здоровых„

Полученные результаты в РИА на клетках разных лимсХ ид.ных органов взрослых коров и их эмбрионов также показывают, что наибольший процент

91643295 О

реактивности дают клетки эмбрнональ-И А для определения уровня раствориных лимфатических узлов и селезенки,мого в сыворотке коров„

а такие клетки костного мозга взрос-уормула изобретения лих коров, где преобладают клетки В- Штамм культивируемых гидридных

типа°клеток животных Musmusculus L,

Кроме того, монАТ обладают цитоток-ВСКК(Н) К 295 D - продуцент моноклосическим действием в отноиении В-лим-нальных антител против В-лимфоцитов

фоцитов, а также используются в методекрупного рогатого скотао

Изобретение относится к гибридной технологии и может быть использовано для определения В-лимфоцитов коров „ Цель изобретения - получение штамма культивируемых гибридных клеток, продуцирующих моноклональные антитела (монАТ) против IgM коровы UTOMM получают гибридизацией клеток миеломы РЗ.Х63 Ag8u653 с клетками селезенки мышей Balb/c, иммунизированных лимфоцитами крови коров, больных хроническим лимфолейкозом.Штамм культивируют в среде ДМЕМ с 10% сыворотки эмбриона коровы и стандартными добавками, Штамм прививается in vivo в сингенних мылах в виде асцитной опухоли, Птамм проду щруют монАТ класса IgG2b. НонАТ направлены против IgM, находящегося на поверхности клеточ и растворимого в сьшоротке, МонАТ провляют 1унтотоксическое действие в отношении В-лимфоцитов. Титр монАТ в культуральной жидкости 128, в асцитной жидкости 2048, 1Лтамм депонирован под номером ВСКК(П) К1 295D 5 Кл