Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS L - продуцент моноклональных антител к трансферрину человека Советский патент 1991 года по МПК C12N5/20 C12P21/08 

Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано для определения трансферрина в сыворотке крови и моче.

Штамм гибридомы ICIO S 2/0 получают следующим образом.

Мышей линии BaLb/c иммунизируют 3- кратно внутрибрюшинно по 10 мкг высоко- очищенного трансферрина человека: первый раз с полным адъювантом Фрейнда, второй раз с неполным адьюватом Фрейнда и третий раз без адъюванта с интервалом в 1 мес. На третий день после последней иммунизации проводят гибридизацию клеток селезенки иммунизированных мышей с клетками мышиной миеломы Sp2/OAg 14 в

соотношении 108 клеток селезенки на 107 клеток миеломы. В качестве гибридизующе- го агента используют полиэтиленгликоль для газовой хроматографии м.в. 4000. Гибридные клоны рассевают на селективную среду, содержащую гипоксантин (10 ML аминоптерин (4x10 М), тимидин (1,6x10 М) из расчета 10 миеломных клеток на 1 лунку 96-луночного планшета. Через 2 недели проверяют продукцию специфических антител синтезируемых гибридными клонами, иммуноферментным методом с использованием конъюгатов кроличьих- антимышиных антител с пероксиддзой и высокоочищенного трансферрина в качестве антигена. Клонируют гибридами в полужидо о со

2

ел

ком агаре. Полученный после реклонирова- ния клеток из асцитных опухолей активно подуцирующий моноклональные антитела клон переводят в массовую культуру и обозначают ICIOSp2/0. Процент позитивных клонов на второй стадии составляет 70%. Штамм ICIOSp2/0 депонирован в специализированной коллекции перевариваемых соматических клеток Института цитологии АН СССР ВСКК(П) под № 345 Д.

К моменту паспортизации число пассажей штамма ICIOSp2/0 составляет 60 в культуре и 25 на животных.

Штамм характеризуется следующими свойствами.

Среда культивирования: среда Дульбек- ко с 15% сыворотки эмбриона коровы, 1 мм пирувата натрия, 50 мкм меркаптоэтанола и 50 мкг/мл гентамицина. Клетки культивируют в атмосфере воздуха с 7,5% СОа при 37°С. Культура состоит из слабо прикрепляющихся к субстрату клеток. Характер роста - стационарная суспензия. Время удвоения популяции 48 ч, частота пассивирования - через 2-3 сут, кратность рассева 1/2-1 /3, посевная концентрация клеток (1-2)х105 в 1 мл.

Введение клеток штамма в брюшную полость мышей линии BaLb/c вызывает у них образование асцитных опухолей. Доза клеток для введения (2-10)х10 . За 1-2 недели до введения клеток мышей сенсибилизируют внутрибрюшинной инъекцией 0,5 мл минерального масла пристан (2,4,10,14-тет- раметилпентадекан). Время образования асцитных опухолей 10-16 сут. Переваривае- мость асцитов 100-ная.

Маркерный признак: продукция специфических монАТ к трансферрину человека. Класс lylgGL

Подвижность изоферментов глюкозо-6- фосфатдегидрогеназы и лактатдегидрогена- зы характерна для мышиных клеток.

Контаминантов штамма ICIOSp2/0, включая бактерии, грибы, дрожжи и микоп- лазмы, не обнаружено. Характеристика монАТ, Штамм MCIOSp2/0 гибридом продуцирует мышиные моноклональные иммуноглобулины класса G, подкласса G1. Принадлежность иммуноглобулинов к данному классу и подклассу определена методом иммуноферментного анализа с использованием коньюгатов антител к мышиным иммуноглобулинам разных классов и подклассов.

Специфичность антител оценивают методом иммуноблотинга. Для этого проводя электрофорез белков сыворотки человека полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (10%-ный ПААГ, по 20 мг белка на лунку), затем переносят белки на полоски из нитроцеллюлозы и инкубируют с раствором монАТ в концентрации 10 мкг/мл. Связавшиеся с антигеном антитела выявляют при помощи коньюгата кроличьих антител против иммуноглобулинов мыши, меченых пе- роксидазой. При этом выявляется связывание монАТ только с одной белковой зоной, соответствующей белку с м.в. 78 ки- лодальтон, что соответствует м.в. трансфер- рина. Взаимодействие моноклональных антител с какими-либо другими белками сыворотки человека не обнаружено.

Таким образом было установлено, что продуцируемые штаммом антитела специфично реагируют с трансферрином человека.

Штамм гибридомы стабильно продуцирует монАТ к трансферрину человека без изменения аффинитета при длительном культивировании (60 пассажей в культуре и 25 на животных).

Титр моноклональных антител определяют непрямым иммуноферментным методом. Он составляет 1000 для культуральных жидкостей и 106 для асцитных жидкостей, Концентрация монАТ в культуре 100 мкг/мл, в асцитной жидкости 5-6 мг/мл. Для определения константы связывания монАТ инкубировали с несколькими различными концентрациями трансферрина в течение 2 ч, а затем определяли концентрацию несвязавшихся антител методом иммуноферментного анализа. Расчет константы проводили по уравнению Скэтчарда. Она равна (1.35± 0,35)х10 10 М.

Способ криоконсервирования.

Криозащитная среда: культуральная среда с 30% эмбриональной сыворотки коровы и 10% диметилсульфоксида (криопро- тектор). Клетки (10 клеток в 1 мл) суспендируют в холодной криозащитной среде (+4°С). Суспензию разливают в сте- р льные ампулы из расчета (1-2)х107 клеток на ампулу. Ампулы охлаждают до -70°С со скоростью 1°С/мин и переносят в контейнер с жидким азотом.

Для размораживания клеток ампулы извлекают из азота и быстро размораживают до 37°С в водной бане. Клетки дважды отмывают в фосфатном буфере. Получают более 60% жизнеспособных клеток по окрашиванию трипановым синим.

МонАТ из асцитных жидкостей получают путем 3-кратного высаливания сульфатом аммония при концентрации 40% от насыщения с последующим диализом против калийфосфатного буфера рН 7,5 с добав- лением 0,1 М NaCI с последующей

аффинной хроматографией на белке А. Степень очистки иммуноглобулинов поданным электрофореза составляет около 90%.

Пример. Высокоочищенный транс- феррин человека сорбируют на полисти- рольном 96-луночном планшете, внося по 100 мкл раствора трансферрина с концентрацией 10 мкг/мл в фосфатном буфере с рН 7,4 с 0,1 М Nad и инкубируя 1 ч при 37°С. Затем планшеты промывают 3 раза тем же буфером с добавлением 0,05% твина-20 и вносят пероксидазный коньюгат монАТ клона ICIO Sp2/0, полученный периодатным методом, в концентрации 1 мкг/мл в исследуемый образец, содержащий 5-100 мкг

0

трансферрина ( в том же фосфатном буфере). Инкубируют 30 мин, затем отмывают 6 раз тем же буфером с добавлением твина и вносят по 100 мкл субстрата - раствор орто- фенилендиамина 0,25 мг/мл и перекись водорода 0,03%, в ацетатном буфере рН 5,5. Через 15 мин измеряют оптическую плотность при 492 нм. Результаты показывают, что минимально определяемая концентрация трансферрина составляет 78 мгк в 1 мл, Формула изобретения Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L № BCKK (II) 345 Д - продуцент моноклональных антител к трансферрину человека.

Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано для определения трансферрина в сыворотке крови и моче. Штамм получают при слиянии клеток мышиной миеломной линии Sp 2/0- Ag 14-1 с клетками селезенки мышей линии BaLb/c, иммунизированных высокоочищенным трансформатором человека. Гибридные клоны отбирают на селективной среде, содержащей гипоксантин, аминоптерин и тимидин, и клонируют в полужидком агаре. Штамм ICIOSp2/0 хранится в специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Института цитологии АН СССР под № 345Д. Время удвоения популяции 48 ч, частота пассирования 2-3 сут, кратность рассева 1/2 - 1/3. У мышей линии BaLb/c при прививке 2- 10x10 клеток штамма асцитные опухоли образуются через 10-16 сут. Титр моноклональных антител составляет 3 для культуральных жидкостей и 6 для асцйтных жидкостей, концентрация моноклональных антител в культуре составляет 100 мкг/мл, в асцитной жидкости 10 мг/мл. Антитела относятся к классу IgG 1. Чувствительность оп- ределения трансферрина человека составляет 10 мкг/мл. Специфичность мо- нАТ показана методом иммуноблотинга. со с