Способ иммунодиагностики инфекций Советский патент 1991 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для ранней диагностики инфекций.

Цель изобретения - повышение точности способа.

Способ осуществляют следующим образом.

Для проведения диагностического исследодания используют эритроциты из коммерческих антигенных эритроци- тарных диагностикумов для РПГА, а- при отсутствии готовых диагностикумов применяют любой известный способ сенсибилизации антигеном формалинизи- ровэнных или танизированных бараньих эритроцитов. В качестве контрольного (несггецифического) объекта фагоцитоза используют эритроциты, сенсибилизированные субстанцией микробов, не имеющей общих детерминант с субстанцией, которую содержат специфически сенсибилизированные эритроциты, Желательно, чтобы оба вида микробов, субстанции которых используют для приготовления специфического и неспецифического объектов фагоцитоза, принадлежали к одному классу микроорганизмов, а сенсибилизированные эритроциты имели однотипную структуру поверхностных детерминант.

Один из видов эритроцитов окрашивают насыщенным водным раствором анилинового красителя черного или красного цвета, а другой вид - раст вором красителя синего цвета, полученным разведением насыщенного раствора этой краски в 10 раз. При окраске сухого аннулированного диаг- ностикума в ампулу вносят 2 мл краски, тщательно встряхивают и выдерживают в термостате не менее двух суток . Жидкий эритроцитарныи диагности- кум смешивают с раствором краски в равных объемах и помещают в термостат на 5 суток. Взвесь окрашенных эритроцитов отмывают от краски до исчезновения ее следов в нацосадочной жидкости. Кратковременным центрифугированием или отстаиванием взвесь ю освобождают от конгломератов клеток. В камере Горяева подсчитывают содержание эритроцитов во взвеси и развоят ее физраствором до концентрации ) млн.клеток в 1 мл, что соответ- ствует их 0,5-1%-ной концентрации. Сохраняемые в холодильнике взвеси можно длительно (не менее года) использовать цля исследования. Для длительного хранения взвесь следует 20 перенести в ампулы, добавить в них по одной капле разведенной краски, а перед проведением исследования эритроциты однократно отмыть |шзраст- вором и развести до нужной концентра-25 Ции.

При диагностике бактериальных инекций используют два вида эритроцитов, содержащих специфическую субстанцию микробов. Для определения специ- JQ ического изменения фагоцитоза, связанного с образованием специфических антител, применяют эритроциты, соержащие антиген, а для определения специфической реакции фагоцитов в на- ,, чальном периоде инфекции, до возникновения имунной реакции, - эритроциты, содержащие сложный комплекс антигена и антитела. Для приготовления последних эритроциты, содержащие антиген, Q инкубируют в течение 1 ч с соответствующей иммунной сывороткой активностью 8-16 гемагглютинирующих единиц по РПГА, отмывают их два раза от несБЯзаишсйся сыворотки и инкубируют в течение 1 ч с надосадочной жидкостью из взвеси соответствующих бактерий ли с раствором специфического полисахарида или липополисахарида активостью не ниже 5 антигенных единиц по РТПГА. Эритроциты трижды отмывают от есвязавшейся части антигена и развоят до нужной концентрации. Аналогичным образом подготавливают эритроциты, содержащие неспецифический антиген ,55

Перед проведением диагностического исследования у больного и постоянного контрольного лица, заведомо не

50

, Q 5

0

имеющего диагностируемой инфекции, берут из пальца кровь в объеме 0,05- 0,10 мл, стабилизируют ее любым антн- коагулянтом (0,01 мл гепарина,разведенного в соотношении 1:20; 3%-ный раствор цитрата натрия в соотношении 2:3 и т.д.). При невозможности использования одного постоянного донора берут кровь от двух любых здоровых людей. Каждую пробу крови вносят в отдельную пробирку в объеме 0,025- 0,050 мл, добавляют -равный объем смеси взвесей специфического и неспецифического объектов фагоцитоза и помещают в термостат на 5-20 мин. Пробирки регулярно встряхивают. Мазки из каждой пробы готовят на отдельном предметном стекле. Мазки фиксируют и окрашивают по Романовскому-Гим- зе, микроскопируют под иммерсионным объективом, одновременно учитывая фагоцитоз двух объектов, из которых одни имеют светло-синюю, а другие - темно-красную или черную окраску. Определяют фагоцитарную активность 100 лейкоцитов. Площадь мазка условно делят на три части и в каждой части учитывают по трети от общей суммы учитываемых лейкоцитов. Желательно, чтобы общая сумма фагоцитированных эритроцитов была не менее 100. Если при учете 100 лейкоцитов цифра фагоцитоза ниже этой реличины, подсчет фагоцитоза продолжают до получения нужной суммы. По окончании подсчета вычисляют процент фагоцитирующих клеток и среднее число фагоцитированных эритроцитов каждого вида на один из учтенных лейкоцитов (фагоцитарное число). Последний показатель более информативен, поэтому можно ограничиться только его определением. Фагоцитоз эоих видов эритроцитов у больного выражают в процентах к соответствующим показателям фагоцитоза у контрольного лииа. Если в качестве контроля используют два лица, то для расчета процента берут средние величины фагоцитоза у этих лиц. Делят относительные показатели фагоцитоза специфического и неспецифического объектов у больного и при величине отношения больше 1,5 и меньше 0,66 диагностируют инфекцию. Полученную относительную величину обозначают как индекс специфического изменения фагоцитоза (ИСФ). Величина индекса выше 1,5 указывает на специфическое

усиление фагоцитоза, а ниже 0,66 - на его специфическое снижение.

Способ можно применять также при использовании в качестве объекто фагоцитоза бактерий, подобрав для микроскопического различения бактерии, отличающиеся в мазках крови по окраске или форме. Концентрация каждого вида бактерий во взвеси должна быть около 1 млрд.микробных тел на 1 мл. Само исследование осуществляют аналогично описанному для эритроцитов.

Пример 1. Применение способа при диагностике кори.

Для проведения диагностического исследования использовали в качестве специфического объекта фагоцитоза эритроциты из сухого коревого антигенного диагностикума для РИГА производства Ленинградского НИИЭМ им.Пас- тера и в качестве неспецнфического объекта - эритроциты из сухгго гриппозного антигенного диагностикума дл РПГА типа А Одесского предприятия по производству бактерийных препаратов. Первый вид эритроцитов окрашен синей краской, второй - черной. В процессе окрашивания оба вида эритроцитов сохранили свои антигенные свойства.

Предварительно в исследованиях у 197 лиц контрольных групп, состоявши из здоровых непривитых и привитых против кори детей, больных краснухой и контактных по ней, детей с аллергическими реакциями кожи, и у взрослых, не болевших и переболевших в прошлом корью, было установлено, что индекс

5

5

0

5

дня кори. Позднее был подтвержден клиническим развитием болезни и положительным результатом определения противокоревых антител в парных сыворотках.

При обследовании 54 больных корью в катаральном периоде и на 1-8-й дни высыпания у 48 выявлено достоверно значимое изменение величины ИСФ (89% от числа обследованных). В том числе ИСФ выше 1,50 устгловлен у A3 больных и ниже 0,66 - у пяти. В катаральном периоде и в первью два дня высыпания положительная реакция был,) у всех обследованных (24 человека) и на 3-4-й дни от начяла высыпания - у 20 из 22 (91% положительных результатов).

При определении титров противо- коревых антител и антител к шигеллам Зонне в РИГА с расчетом индексов специфического повышения титров антител по соотношению титров антител к этим двум антигенам установлено, что у больных корью повышен титр про- тивокорепых антител в среднем в 20 раз в сравнении с контрольной группой детей, не болевших корью и не привитых против нее. У всех больных индекс спегдефического повышения титров выше 4,0, ч го свидетельствует о наличии в организме больных специфических противокоревых антител. Однако такие же покчзатели противокоревых антител обнаружены у лиц из всех других контрольных групп, в том числе больных не коревыми инфекциями, У лиц этих групп индекс специфического

Изобретение относился к области медицины и может быть использовано для ранней диагностики инфекций. Целыо изобретения является повышение точности диагностики. Цель достигается путем добавления исследуемой кро- ви к специфическому и неспецифическому эритроцит арному предизрительно окрашенному диагностикуму с последующим определением фагоцитарной активности лейкоцитов крови н оценкой результатов реакции по соотношению показателей между специфическим и неспецифическим диагностикумами у больных и здоровых лиц. При соотношении показателей больше 1,5 и меньше 0,66 диагностируют инфекцию. Способ позволяем повысить точность диагностики дп 1007, в начале заболевания.

соотношения фагоцитоза коревых и грип-дл повышения титров противокоревых анти- позных эритроцитов не выходит за пре- тел был в тех же пределах, что и

у больных корью (8-128). На этом основании при однократном исследовании оказалось невозможным дифференцировать больных корью и не болевыших

делы его контрольных значений 0,66- 1,50.

Двое детей в возрасте 8 мес и 6 лет поступили в инфекционную больницу на J-и и 3-й дни заболевания с подозрением на корь. При исследовании определено, что у одного фагоцитоз коревых эритроцитов составил к их фагоцитозу у контрольного лица 109%, а фагоцитоз гриппозных эритроцитов 45%, ИСФ равен 2,43. У второго ребенка те же показатели по отношению к показателям контрольного лица составили 56 и 25%, а ИСФ 2.24. На основании исследования было дано заключение о наличии у обоих больных специфического изменения фагоцитарной активности лейкоцитов, характерного

45

50

55

этой инфекцией. Только при исследовании парных сывороток, полученных с разницей во времени в 2-3 недели, четырехкратное нарастание титров противокоревых антител удалось определить у 50% больных корью, а при расчете индексов специфическою повышения титров путем сравнения этих двух сывороток диагностическая величина индекса 4 и выше получена у 82% больных. Таким образом, исследование по предлагаемому способу позволяет диагностировать корь на 2-3 недели раньше в сравнении с оггределеу больных корью (8-128). На этом основании при однократном исследовании оказалось невозможным дифференцировать больных корью и не болевыших

5

0

5

этой инфекцией. Только при исследовании парных сывороток, полученных с разницей во времени в 2-3 недели, четырехкратное нарастание титров противокоревых антител удалось определить у 50% больных корью, а при расчете индексов специфическою повышения титров путем сравнения этих двух сывороток диагностическая величина индекса 4 и выше получена у 82% больных. Таким образом, исследование по предлагаемому способу позволяет диагностировать корь на 2-3 недели раньше в сравнении с оггределекием индексов специфического повышения титров антител и повышает результативность диагностики.

П р и м е р 2. Применение способа , при диагностике дизентерии.

Для проведения диагностического исследования использовали сухие антигенные эритроцитарные диагностику из шигелл Зонне и Флекснера Ленин- JQ градского НИИ вакцин и сывороток. Приготовлено два диагностических набора: один - из контрастно окрашенных эритроцитов, содержащих антигены Зонне и Флекснер; другой - из этих же эритро- )$ цитов с дополнительным присоединением к ним гомологичных, антител и липополисахаридов. Для исследования фагоцитарной активности лейкоцитов использовали 1%-ные взвеси всех ви- JQ дов эритроцитов.

У больной, поступившей в отделение кишечных инфекций на 3-й день заболевания с подозрением на дизентерию, было проведено исследование по пред- 25 лагяемому способу в день поступления и через 8 дней. Одновременно проведено исследование с кровью двух доноров. В одну порцию каждой пробы крови добавили смесь взвесей эритроцитов, 30 сенсибилизированных антигенами Зонне и Фпекснер, в другую порцию - эритроциты, содержащие сложный комплекс этих антигенов и антител. Показатель флагоцитарного числа в отношении всех „ видов эритроцитов у больной выражен в процентах к средней величине фаго- цитоза каждого вида эритроцитов у контрольных лиц. У больной показатели составили в отношении разных эритро- до цитов: с антигеном Зонне 171%, с антигеном Фпекснер 167%, содержащих комплекс из антигена и антитела Зонне 161% и комплекс из антигена и антитела Флекснер 292%. ИСФ по соотно- д$ шению фагоцитоза первых двух видов эритроцитов близок к единице, а по соотношению фагоцитоза эритроцитов с комплексом Флекснер н Зоине 1,81. На основании исследования было дано заключение о наличии у больной дизентерии Флекснер в фазе циркуляции в крови субстанций шигелл Флекснера при отсутствии иммунной реакции. Че- рез неделю у этой больной было полу- чено бактериологическое подтверждение дизентерии с выделением шигелл Флекснера 2а. Исследование через 8 дней выявило повышение ИСФ до 1,79

55

,

JQ )$ JQ

25 30 „ до д$

5

по соотношению фагоцитоза эритроцитов, содержащих антигены Флекснера и Зонне, и отсутствие реакции на эритроциты, содержащие сложный комплекс антигена и антитела. Результаты исследования указывают на прекращение циркуляции антигена в крови и наличие иммунной реакции. Исследование в РПГА титров антител к шигеллам Зонне и Флекснера при поступлении показало отсутствие значимого специфического сдвига титров антител (индекс ниже 4,0). При втором исследовании отношение титров к шигеллам Флекснера и Зонне указывало на наличие диагностически значимого сдвига (превышение титра антител к шигеллам Флекснера в 8 раз и величина индекса равна 8), что также подтвердило диагноз дияен- терии Ллекснера.

Предлагаемым способом обследовано 24 больных острой дизентерией, в том числе 16 с дизентерией Флекснера и 8 с дизентерией Зонне. У 17 больных срок заболевания был 2-4 дня и у 7 - 6-17 дней. Диагностически значимое повышение индекса с величиной ИСФ выше 1,5 получено у 22 больных (91,7% положительных результатов). Из них у 21 больного было полное совпадение заключения о типе шигелл с данными бактериологического исследования. При исследовании титров антител в РПГА диагностически значимое повышение индекса соотношения титров антител к обоим видам шигелл установлено у 9 больных (38% положительных результатов), в том числе в первые 2-4 дня заболевания у 5 из 17 (29% положительных результатов).

При обследовании 57 больных соматическими заболеваниями и сальмонел- леэом Ифимуриум ни у одного больного не выявлено специфического изменения фагоцитоза эритроцитов, содержащих субстанции шигелл.

П р и м е р 3. Применение способа при диагностике туберкулеза.

Для диагностического исследования использованы сухие антигенные эритро- цитарные диагностикумы для РИГА Ленинградского НИИ вакцин и сывороток - туберкулезный (фосфатидный) и из шигелл Зонне (неспецифический объект фагоцитоза). Оба вида эритроцитов окрашены в контрастные цвета. Из туберкулезных эритроцитов приготовлены клетки с Присоединением к ним

10

15

20

25

91627992

антител из прилагаемой к диагностику- у иммунной сыворотки с последующей фиксацией на ни: , специфической субстанции надосадочьой части центрифу- гата взвеси БЦЖ. Эритрочиты со сложным комплексом из шигелл Зонне получены описанным спосо&пм. Для исследования использовали %-ные взвеси эритрош:тов, беря смеси однотипных по структуре эритроцитов.

При обследовании 500 детей, вакцинированных и невакцинировлнных БЦЖ и не болеюцих туберкуле зом, установлено, что в первые два года после вакиинэиии выявляется специфическое повышение фагоцитоза. После этого срока реакция исчезает и при отсутствии туберкулеза величина ИСФ не выходит за пределы vонтрольного ния. У взрослых, не болевгих еэом, исследование предлагаемым способом также выявило oicyicisne специфического изменения ф,т оцыоз.1. Таким о бра ом, у детей стгрнк.- дяух ет и взрослых выявление one ннфнчег- ксго изменения фагоци; озч п отно не- нии эритроцитов, содержащих сублан- ции губеркулезчьо ми р бактерии, ян- ляетса диагнос п:ч ским приз- ком TV- беркулезной и 1фекции,

У больной 14 лет, чоступчь ией в клинику для обследования на губерку- леч, при исследовании одновременно. с двумя донорами установлены слод,.«- щие показатели фагоци аркогг числа в процентах к сродним данным д нирол: в отношении эритроцитов, с.дерлаинх туберк ле°ный ант HI ен, 1 27/1, не специфический ангшен 61%, компл1М v туберкулезных аншгена и антитела 78/ и дизентеринныи м мплекс 59. ИСФ по соотношению фагоцитоза гервь -- двух

ВИДОВ ЭРИТРОЦИТОВ СОСТЧВИЛ 2, J8 И

двух других 1,32. Данные mr тедона- ния указывает на наличие j:, беркуле за в фазе иммунной реакции. По резул; ii там комплексного обследования Сольной был поставлен диагноз туберкулеза. Бактериологическое исследование на туберкуле ч дало отрицательная результат ,

Предлагаемым способом обследовано 172 ребенка, больных и инфицированных туберкулезом, и 18 взрослых. Положительный диагностический результат при однократном исследовании получен у 81,2%. Определение антител у этих больных не проводили из-за

30

35

40

с

45

50

55

1

0

5

0

5

992

0

5

0

;о

отсутствия нужного количества днлг- ностнкума.

Преимущество предлагаемого способа иммунодиагностики в сравнении со способом определения титров антител в РПГА и расчетом индекса соотношения тигров специфических и неспеци- фичес их антител в сопоставлении с их соотношением у контрольных лиг, з клкч ется в повышении точности. При исследовании предлагаемым спосо- 5.м специфический и неспецифический показатели огпеделяют в одной порщш крови, а при исследовании известным с.юссРом по-казятель определяют в разных порциях. Поэтому по предла- способу диагностически начи- мо повышение индекса выше 1,5, а по известному - выше 4, Кроме того, по известному способу диагностический критерий L только для случая по мчд-ния тигра спе1Щфичес сих антител, а СО1ЧГГЧЮ noennarafMONfy - тзкке для случ 14 спепнспнческой депрессии показатели (шпеке ниже 0, 66) .

В соответствии с от им предлагаемый ( т.особ МО-толя т раньше диагнос- upoji iTti ннпч кцик. В частности, при дизентерии иродлаглемый способ дает в перчые 4 дчн заболевания свыше 90% пп.чож1чельныт- результатов, а известный гпогоб - около 30%. Таким обра- ом предтя аемыи способ в началь- н т ( i 1ччи шПотевания в три раза

фф( 1 ПЬНРС .

IV енно значительно преимущество предлтгасмпго способа и сроках дна1Чосгики п,и кори, когда определе- ии aiMHioiT у оольпых эффективно тотьКО црн ИС С Г-; 1ЯПНИН г 1рНЫ Г11ПО5

0

5

PI о к и птрптяет полуи,1Г диагностический резулти if через 2-J подели от н,,1 заболевания. Предлагаемый способ дает п начале чаболевания 100%-мы1 тюлол ителы Ь.н ре1ульттт, 41 о позволяе диагностпрова ь корь на 2-3 подели рань че.

Пр f.ni способ позволяет оп- .ш1ь т-ai с 1язанное с с бразованием иммунных антител, так и не связанное с ним специфическое изменение Лагоцн- тарной активноеги лейкоцитов. Иммунодиагностика по известному способу цочво яет определять инсЬокцию только при возникновении иммунной реакции. В связи с этим предлагаемый способ позволяет дифференцировать корь от других инфекций, а при применении

II

известного способа при однократном исследовании крови это невозможно. Предлагаемой способ значительно эффективнее известного способа иммунодиагностики за счет определения фа гоцнтарной активности лейкоцитов в отношении микробов. Известный способ не стандартизован и не дает унифицированного количественного критерия диагностики. Предлагаемый способ вво дит такой критерий. Кроме того, применение известного способа ограничено кругом бактериальных инфекций, а предлагаемый способ универсально применим для диагностики любой инфек

НИИ.

Изобретение может быть применено в практическом здравоохранении с использованием известных и широко доступных средств иммунодиагностики инфекций.

Формула изобретения

Способ иммунодиагностики инфекций . путем добавления исследуемой крови к специфическому и неспецифическому эритроцитарному диагностикуму с последующей оценкой результатов реакции по соотношению показателей между спе10 цифическим и неспецифическим диагностику мами у больных н здоровых л-яц, отличающийся тем, что, с целью повышения точности способа, к исследуемой крови добавляют смесь

15 предварительно окрашенных эритроци- тарных диагностикумов, а оценку результатов ведут по определению фагоцитарной активности лейкоцитов и при соотношении показателей больше

20 1,5 и меньше 0,66 диагностируют инфекцию.